Detecting eDNA – The Importance of Assay Specificity and Sensitivity Part I: An Introduction to the MIQE Guidelines and DNA Sequence Database Generation & Curation for qPCR Assay Design

MIQE - uma breve introdução

Em 2009, Bustin e colegas[1] codificaram um conjunto de requisitos mínimos para a publicação de dados quantitativos da reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR), aparentemente para uso nos campos da medicina clínica e biologia molecular, como forma de garantir conjuntos de dados rigorosos que permitam aos investigadores quantificar alterações sutis na expressão de genes particulares ou na estimativa da carga viral, por exemplo. Nos estudos de expressão gênica, mudanças fracionárias na produção de moléculas mensageiras intracelulares, chamadas mRNAs, que transmitem informação genética codificada em genes à sua forma proteica ou final, precisam ser percebidas para testar hipóteses cruciais de importância fisiológica, médica e até evolutiva e ecológica. Bustin et al. abordam alguns dos padrões mínimos obrigatórios que precisam ser relatados para garantir a detecção contínua e robusta dos ácidos nucléicos em baixas concentrações. Estes padrões foram denominados as diretrizes do MIQE: Minimal Informação para a publicação de QPCR uantitativa Experiments.

Discutiremos essas diretrizes e como elas se comparam com os padrões de eDNA em futuros cargos, mas por enquanto divulgaremos a principal diferença entre os estudos que invocam o MIQE e aqueles que envolvem a quantificação do DNA ambiental usando qPCR: que as concentrações de eDNA, dependendo das circunstâncias em que é coletado, provavelmente serão várias ordens de magnitude inferiores a muitas mudanças observadas no nível de expressão de mRNA ou níveis absolutos de genomas virais presentes nos tecidos. Consequentemente, precisamos modificar os padrões MIQE para assegurar que as pesquisas de eDNA sejam protegidas de acusações de padrões muito frouxos que podem resultar na ocorrência significativa de erros dos tipos I e II (falsos positivos e negativos, respectivamente). Como o ADN antigo (aDNA) antes, a detecção de eDNA tem de elevar estes padrões a um nível mais elevado, dada a natureza muito mais efémera das moléculas alvo nos sistemas naturais contemporâneos.

A Importância da Especificidade e Sensibilidade

Compartilhado com aDNA e aplicações biomédicas de ensaios qPCR, é uma dependência vital de duas pedras de toque de detecções de base molecular: especificidade(ou: qual é a probabilidade de detectar incorretamente um não alvo, o que pode levar a erro Tipo I se não for totalmente específico para o(s) alvo(s)? e sensibilidade (ou: qual é a probabilidade de detectar concentrações extremamente baixas da espécie alvo, o que, se não for quantificado, pode levar a erro Tipo II?] O primeiro passo para minimizar essas potenciais fontes de erro é projetar ensaios extremamente robustos em silico, o que depende, crucialmente, de se ter dados genômicos substanciais de organismos alvo e simpáticos (co-distribuídos) não-alvo com os quais se possa projetar ensaios altamente discriminatórios. Para isso, a informação genômica é primordial; é preciso coletar e curar um corpo significativo de informações de seqüência genética.

A Informação é a Chave - Uma Justificação Evolutiva e Populacional para a Geração e Cura de Dados

Quanta informação genómica é suficiente? E como podemos explicar os altos níveis de variação genética dentro da espécie e os baixos níveis de divergência de sequência genómica entre espécies estreitamente relacionadas, irmãs e/ou crípticas? Todas as excelentes perguntas, e cada uma precisa ser respondida satisfatoriamente, ou não se pode, com boa consciência, publicar ou disponibilizar um ensaio genérico para a espécie alvo em questão.

Coda

Neste post, discutimos amplamente a coleta e a curadoria de dados para a concepção de um ensaio específico para uma espécie a ser geralmente implantado em toda a gama de uma espécie, ou pelo menos nas populações a partir das quais os dados da sequência foram gerados. Aqui na PBI, também estamos desenvolvendo novas formas de provocar a separação até mesmo de espécies extremamente próximas, com baixos níveis de variação de nucleotídeos. Em uma linha semelhante, também esperamos projetar ensaios específicos de populações que podem ser capazes de visar unidades significativas evolutivas individuais (UECs) e unidades de manejo ou conservação (UCMs)[9].

No próximo blog, vamos desenvolver ainda mais os padrões mínimos exigidos de um ensaio eDNA qPCR confiável, robusto e respeitável, e como esses requisitos estendem e embelezam os das diretrizes do MIQE. Vamos tratar com algum detalhe os conceitos de LOD (limite de detecção) e LOQ (limite de quantificação) e perguntar: quais são os parâmetros cruciais do ensaio requerido (CARP) para projetar, otimizar e validar ensaios de eDNA?

[1] Bustin et al. (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of qPCR experiments. Clinical Chemistry 55, doi.org/41373/clinch.2008.112797.

[2] Lahoz-Monfort et al. (2015). Abordagens estatísticas para contabilizar falsos erros positivos em amostras de DNA ambiental. Molecular Ecology Resources, 16, doi: 10.1111/1755-0998.12486.

[3] Hale et al. (2012). Sampling for Microsatellite-Based Population Genetic Studies: 25 to 30 individuals per population Is enough to accurately estimate allele frequencies.  PloS One, doi: 10.1371/journal.pone/0045170

[4] Luo et al. (2018). Herança biparental do DNA mitocondrial em humanos. Anais da Academia Nacional de Ciências, doi: 10.1073/pnas.1810946115

[5] Benasson et al. (2001). Mitochondrial pseudogenes: evolution's wrongplaced witnesses. Trends in Ecology and Evolution, 16, 314-321.

Smith & Smith (1996). Divergência sinônima de nucleotídeos: o que é "saturação"? Genetics, 142, 1033-1036.

[7] Felsenstein J (2003). Inferring Phylogenies, Sunderland (Sinauer).

8] Crête-Lafrenière et al. (2012). Enquadramento do retrato filogenético da família Salmonidae: uma imagem mais completa a partir do aumento da amostragem do taxon. PloS One, doi: 10.1371/journalpone.0046662.

[9] Palsbøll et al. (2006). Identificação de unidades de manejo utilizando dados genéticos da população. Trends in Ecology and Evolution, 22, 11-16.

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