Detecting eDNA – The Importance of Assay Specificity and Sensitivity Part I: An Introduction to the MIQE Guidelines and DNA Sequence Database Generation & Curation for qPCR Assay Design

MIQE - une brève introduction

En 2009, Bustin et ses collègues[1] ont codifié un ensemble d'exigences minimales pour la publication de données quantitatives en temps réel sur l'amplification en chaîne par polymérase (qPCR), apparemment destinées aux domaines de la médecine clinique et de la biologie moléculaire, afin de garantir des ensembles de données rigoureux qui permettent aux chercheurs de quantifier les changements subtils dans l'expression de gènes particuliers ou dans l'estimation de la charge virale, par exemple. Dans les études sur l'expression des gènes, les changements fractionnaires dans la production de molécules messagères intracellulaires, appelées ARNm, qui transmettent l'information génétique codée dans les gènes à leur forme protéique ou finale, doivent être perçus de manière à tester des hypothèses cruciales d'importance physiologique, médicale et même évolutive et écologique. Bustin et al. abordent certaines des normes minimales obligatoires qui doivent être signalées pour assurer une détection robuste continue des acides nucléiques à faibles concentrations. Ces normes ont été appelées les lignes directrices MIQE : Minimal Information pour la publication de QPCR quantitatif Expériences.

Nous discuterons de ces directives et de leur comparaison avec les normes de l'ADNe dans les prochains articles, mais pour l'instant nous divulguerons la principale différence entre les études qui invoquent le MIQE et celles qui impliquent une quantification environnementale de l'ADN à l'aide du qPCR : les concentrations d'ADNe, selon les circonstances dans lesquelles il est collecté, sont susceptibles d'être inférieures de plusieurs ordres de grandeur à de nombreux changements observés dans le niveau d'expression de l'ARNm ou les niveaux absolus des génomes viraux présents dans les tissus. Par conséquent, nous devons modifier les normes MIQE pour garantir que les enquêtes sur l'ADNe soient protégées des accusations de normes trop laxistes qui peuvent entraîner l'apparition importante d'erreurs de type I et II (faux positifs et négatifs, respectivement). Comme l'ADN ancien (ADNa) auparavant, la détection de l'ADNe doit élever ces normes à un niveau supérieur étant donné la nature beaucoup plus éphémère des molécules cibles dans les systèmes naturels contemporains.

L'importance de la spécificité et de la sensibilité

Partagée avec l'ADN et les applications biomédicales des tests de RCPQ, elle dépend de deux pierres de touche de la détection moléculaire : la spécificité (ou : quelle est la probabilité de détecter incorrectement une non-cible, ce qui peut entraîner une erreur de type I si elle n'est pas totalement spécifique à la ou aux cibles ?) et la sensibilité (ou : quelle est la probabilité de détecter des concentrations extrêmement faibles de l'espèce cible, ce qui, s'il n'est pas quantifié, peut entraîner une erreur de type II? La toute première étape pour minimiser ces sources potentielles d'erreur consiste à concevoir des tests in silico extrêmement robustes, ce qui dépend, de manière cruciale, de la disponibilité de données génomiques substantielles provenant des organismes cibles et des organismes sympatriques (co-distribués) non cibles avec lesquels concevoir des tests hautement discriminants. Pour ce faire, l'information génomique est primordiale ; il faut recueillir et conserver un ensemble important d'informations sur les séquences génétiques.

L'information est la clé - Une justification de l'évolution et de la génétique des populations pour la génération et la conservation des données

Quelle quantité d'informations génomiques est suffisante ? Et comment expliquer les niveaux élevés de variation génétique au sein d'une même espèce et les faibles niveaux de divergence des séquences génomiques entre des espèces étroitement apparentées, sœurs et/ou cryptiques ? Autant d'excellentes questions auxquelles il faut répondre de manière satisfaisante, faute de quoi on ne peut en toute bonne conscience publier ou mettre à disposition un test générique pour l'espèce cible en question.

Coda

Dans cet article, nous avons largement discuté de la collecte et de la conservation des données pour concevoir un essai spécifique à l'espèce qui sera généralement déployé dans toute l'aire de répartition d'une espèce, ou au moins dans les populations à partir desquelles les données de séquence ont été générées. Ici, à l'IBP, nous développons également de nouvelles méthodes pour séparer même des espèces très proches les unes des autres avec de faibles niveaux de variation nucléotidique. Dans le même ordre d'idées, nous espérons également concevoir des tests spécifiques aux populations qui pourraient être capables de cibler des unités significatives pour l'évolution (USE) et des unités de gestion ou de conservation (UG/C) individuelles[9].

Dans le prochain blog, nous développerons plus avant les normes minimales requises d'un test qPCR d'ADN électronique fiable, robuste et réputé, et comment ces exigences étendent et embellissent celles des lignes directrices du MIQE. Nous traiterons en détail les concepts LOD (limite de détection) et LOQ (limite de quantification) et nous demanderons : quels sont les paramètres requis (CARP) pour la conception, l'optimisation et la validation des tests ADNe ?

[1] Bustin et al. (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of qPCR experiments. Clinical Chemistry 55, doi.org/41373/clinch.2008.112797.

(2 ) Lahoz-Monfort et al. (2015). Approches statistiques pour tenir compte des erreurs faussement positives dans les échantillons d'ADN environnementaux. Molecular Ecology Resources, 16, doi : 10.1111/1755-0998.12486.

[3] Hale et al. (2012). Sampling for Microsatellite-Based Population Genetic Studies: 25 to 30 individuals per population Is enough to accurately estimate allele frequencies.  PloS One, doi: 10.1371/journal.pone/0045170

(4 ) Luo et al. (2018). Héritage biparental de l'ADN mitochondrial chez l'homme. Actes de l'Académie nationale des sciences, doi : 10.1073/pnas.1810946115

(5 ) Benasson et al. (2001). Mitochondrial pseudogenes : evolution's misplaced witnesses. Trends in Ecology and Evolution, 16, 314-321.

[6] Smith & Smith (1996). Divergence des nucléotides synonymes : qu'est-ce que la "saturation" ? Genetics, 142, 1033-1036.

[7] Felsenstein J (2003). Inferring Phylogenies, Sunderland (Sinauer).

(8 ) Crête-Lafrenière et al. (2012). Encadrement du portrait phylogénétique de la famille des Salmonidés : une image plus complète grâce à un échantillonnage accru des taxons. PloS One, doi : 10.1371/journalpone.0046662.

(9 ) Palsbøll et al. (2006). Identification des unités de gestion utilisant les données génétiques des populations. Trends in Ecology and Evolution, 22, 11-16.

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