Detecting eDNA – The Importance of Assay Specificity and Sensitivity Part I: An Introduction to the MIQE Guidelines and DNA Sequence Database Generation & Curation for qPCR Assay Design

MIQE - una breve introducción

En 2009, Bustin y sus colegas[1] codificaron un conjunto de requisitos mínimos para la publicación de datos cuantitativos en tiempo real sobre la reacción en cadena de la polimerasa (qPCR), aparentemente para su uso en los campos de la medicina clínica y la biología molecular, como medio de garantizar conjuntos de datos rigurosos que permitan a los investigadores cuantificar cambios sutiles en la expresión de determinados genes o en la estimación de la carga viral, por ejemplo. En los estudios de expresión genética, los cambios fraccionados en la producción de moléculas mensajeras intracelulares, denominadas ARNm, que transmiten la información genética codificada en los genes a su forma proteínica o final, deben ser percibidos de manera que se puedan probar hipótesis cruciales de importancia fisiológica, médica e incluso evolutiva y ecológica. Bustin y otros abordan algunas de las normas mínimas obligatorias que deben notificarse para asegurar la continua y sólida detección de los ácidos nucleicos en bajas concentraciones. Estas normas se denominaron directrices MIQE: Minimal Información para la publicación de QPCR cuantitativa EExperimentos.

Discutiremos estas directrices y cómo se comparan con las normas de eDNA en futuros artículos, pero por ahora divulgaremos la principal diferencia entre los estudios que invocan el MIQE y los que implican la cuantificación del ADN ambiental mediante qPCR: que las concentraciones de eDNA, dependiendo de las circunstancias en que se recoja, probablemente sean varios órdenes de magnitud inferiores a muchos cambios observados en el nivel de expresión del ARNm o los niveles absolutos de los genomas virales presentes en los tejidos. Por consiguiente, es necesario modificar las normas de la MIQE para garantizar que los estudios de eADN estén protegidos contra las acusaciones de normas demasiado laxas que puedan dar lugar a una importante incursión de errores de los tipos I y II (falsos positivos y negativos, respectivamente). Al igual que antes el ADN antiguo (aDNA), la detección de eDNA tiene que elevar estos estándares a un nivel más alto dada la naturaleza mucho más efímera de las moléculas objetivo en los sistemas naturales contemporáneos.

La importancia de la especificidad y la sensibilidad

Compartido con el ADN y las aplicaciones biomédicas de los ensayos de qPCR, es una dependencia vital de dos piedras de toque de las detecciones de base molecular: la especificidad (o: ¿cuál es la probabilidad de detectar incorrectamente un no-objetivo, que puede conducir a un error de Tipo I si no es totalmente específico del objetivo o objetivos?) y la sensibilidad (o: ¿cuál es la probabilidad de detectar concentraciones extremadamente bajas de la especie objetivo, que, si no se cuantifican, pueden conducir a un error de Tipo II? El primer paso para reducir al mínimo estas posibles fuentes de error es diseñar ensayos extremadamente robustos en silicio, lo que depende, de manera crucial, de que se disponga de datos genómicos sustanciales de los organismos objetivo y de los organismos simpáticos (codistribuidos) no objetivo con los que diseñar ensayos altamente discriminatorios. Para ello, la información genómica es primordial; hay que reunir y conservar un volumen importante de información sobre la secuencia genética.

La información es clave - Una razón evolutiva y de genética poblacional para la generación y conservación de datos

¿Cuánta información genómica es suficiente? ¿Y cómo podemos explicar los altos niveles de variación genética dentro de la especie, y los bajos niveles de divergencia de la secuencia genómica entre especies estrechamente relacionadas, hermanas y/o crípticas? Todas las preguntas son excelentes y cada una de ellas debe ser respondida satisfactoriamente, o no se puede, con buena conciencia, publicar o poner a disposición un ensayo genérico para la especie objetivo en cuestión.

Coda

En este artículo, hemos tratado ampliamente la recopilación y el cotejo de datos para diseñar un ensayo específico para cada especie que se desplegará en general en toda el área de distribución de una especie, o al menos en las poblaciones a partir de las cuales se generaron los datos de la secuencia. Aquí en PBI, también estamos desarrollando nuevas formas de separar incluso especies extremadamente cercanas con bajos niveles de variación de nucleótidos. En una línea similar, también esperamos diseñar ensayos específicos de poblaciones que puedan ser capaces de dirigirse a unidades evolutivas significativas individuales (ESU) y unidades de gestión o conservación (M/CU)[9].

En el próximo blog, desarrollaremos más los estándares mínimos requeridos de un ensayo fiable, robusto y de buena reputación de eDNA qPCR, y cómo estos requisitos extienden y embellecen los de las directrices de MIQE. Trataremos con cierto detalle los conceptos LOD (límite de detección) y LOQ (límite de cuantificación) y nos preguntaremos: ¿cuáles son los parámetros cruciales del requisito del ensayo (CARP) para diseñar, optimizar y validar los ensayos de eDNA?

[1] Bustin et al. (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of qPCR experiments. Clinical Chemistry 55, doi.org/41373/clinch.2008.112797.

2] Lahoz-Monfort y otros (2015). Enfoques estadísticos para dar cuenta de los errores de falsos positivos en las muestras de ADN del medio ambiente. Molecular Ecology Resources, 16, doi: 10.1111/1755-0998.12486.

[3] Hale et al. (2012). Sampling for Microsatellite-Based Population Genetic Studies: 25 to 30 individuals per population Is enough to accurately estimate allele frequencies.  PloS One, doi: 10.1371/journal.pone/0045170

4] Luo et al. (2018). Herencia biparental del ADN mitocondrial en los humanos. Actas de la Academia Nacional de Ciencias, doi: 10.1073/pnas.1810946115

5] Benasson y otros (2001). Seudogenes mitocondriales: los testigos fuera de lugar de la evolución. Trends in Ecology and Evolution, 16, 314-321.

[6] Smith & Smith (1996). Sinónimo de divergencia de nucleótidos: ¿qué es la "saturación"? Genética, 142, 1033-1036.

7] Felsenstein J (2003). Inferring Phylogenies, Sunderland (Sinauer).

8] Crête-Lafrenière et al. (2012). Enmarcando el retrato filogenético de la familia Salmonidae: un pictograma más completo a partir del aumento del muestreo de taxones. PloS One, doi: 10.1371/journalpone.0046662.

9] Palsbøll y otros (2006). Identificación de unidades de gestión utilizando datos genéticos de la población. Trends in Ecology and Evolution, 22, 11-16.

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