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Der TripleLock™ Vorteil

Environmental-DNA (eDNA)-Methoden bieten mehrere Vorteile über konventionelle Methoden der Artenerhebung, insbesondere wenn sie mit dem das richtige Maß an Fachwissen in jedem Schritt des Arbeitsablaufs. Diese Vorteile umfassen Zeit- und Kosteneinsparungen, insbesondere bei der Detektion vor Ort. eDNA bietet höhere Sensitivität und Spezifizität, die die Verzerrung durch den Beobachter im Vergleich zu konventionellen Methoden. eDNA reduziert auch Störungen der Spezies und ihrer natürlicher Lebensraum.

Obwohl die eDNA-Wissenschaft noch relativ jung ist, entwickelt sie sich rasch weiter, wobei viele Aspekte des Erhebungsdesigns, der Stichprobenverfahren und der Laboranalyse als Best Practices - und eines Tages als Industriestandard - akzeptiert werden [1,2]. eDNA-Umfragen, die einer solchen Reihe von Best Practices nicht entsprechen, können jedoch schnell in die Falle einer geringen Nachweiswahrscheinlichkeit und fehlerhafter Ergebnisse tappen. Während eDNA-Umfragen relativ einfach durchzuführen scheinen, kann man nicht einfach eine Wasserprobe in einer Nalgene-Flasche nehmen und in der Hoffnung, eine optimale Nachweiswahrscheinlichkeit zu erreichen oder ein hohes Vertrauen in ihre Ergebnisse zu haben, in ein Labor gehen. Qualitativ hochwertige eDNA-Umfragen werden unter sorgfältiger Berücksichtigung aller Aspekte des Umfragedesigns sowie der Probenerhebung und -verarbeitung durchgeführt.

Hier bei Precision Biomonitoring Inc. haben wir die Plattform TripleLock™ entwickelt, die in ihrem Kern auf den weithin akzeptierten Best Practices für eDNA-Umfragen basiert und uns damit an die Spitze der eDNA-Umfragebranche stellt. Die Durchführung robuster eDNA-Arbeiten ist in diesem frühen Stadium besonders wichtig, wenn eDNA-Methoden akzeptiert werden sollen, damit die Vorteile der eDNA für Umweltbewertungen und Naturschutzbiologie auf der ganzen Welt genutzt werden können. Der Schwerpunkt dieses Blogs wird darauf liegen, die Vorteile der Plattform TripleLock™ und deren Vergleich mit anderen Methoden in der Branche zu skizzieren.

Plattform Kern I: TripleLock™ qPCR-Untersuchungen

Der erste Kern der Plattform TripleLock™ besteht aus qualitativ hochwertige, rigoros validierte qPCR-Assays zum Nachweis eines Ziels Arten. Bei Precision Biomonitoring Inc. haben wir Folgendes konzipiert und entwickelt eine proprietäre Methode für eine stringente Assay-Entwicklung, die es uns erlaubt, konsequent artenspezifische und hochempfindliche qPCR-Assays zu entwerfen und zu validieren. Wir unsere Methode entwickelt, die die Mindestinformationen für Veröffentlichung von Richtlinien für quantitative Echtzeit-PCR-Experimente (MIQE). Die Die MIQE-Richtlinien umreißen mehrere Standards, die eingehalten werden sollten, um und interpretierbaren qPCR-Analysen und durch den Aufbau unserer Plattform auf der Grundlage solcher strenge Standards gewährleisten wir reproduzierbare Ergebnisse bei gleichzeitiger Minimierung von Fehlern. Unser TripleLock™ Assays werden auch nach höchsten internationalen Standards von einer3. Partei ISO 17025 akkreditiertes Labor. Die Vorteile der folgenden genormten Die Methoden sind klar, da sie zu konsistenten Ergebnissen führen. Die Assays müssen diesen strengen Normen entsprechen und nicht einfach von verschiedenen Quellen für Literatur und Berichte vonDritten, da dies in inkonsistenter Standardisierung im gesamten Katalog.

Wir sind stolz darauf, unsere eigenen Assays intern zu entwickeln, da gegen den Erhalt veröffentlichter Assays in der Literatur, da es uns erlaubt Optimierung von Assays mit unseren bewährten Methoden und Geräten. Während die Qualität der Assays in der eDNA-Literatur variieren können, muss man bedenken, dass ein Assay besteht aus mehr als nur einem Primer- und Sondenset, es umfasst genau die Art der qPCR-Reagenzien und Instrumente, mit denen sie validiert wurde. Diese bedeutet, dass die exakte Replikation der Sensitivität veröffentlichter Assays auf verschiedenen Ausrüstung kann zusätzliche Kosten und Zeit verursachen, während sie sich gleichzeitig vom MIQE Standards, wenn die veröffentlichten Testparameter nicht in vitro repliziert werden können.

Zusätzlich sind unsere Assays mit einem internen Positivkontrolle (IPC) zum Nachweis der PCR-Inhibition, eine absolute Notwendigkeit zur Vermeidung falsch negative Ergebnisse. Viele Experten auf dem Gebiet der eDNA-Wissenschaft stimmen darin überein, dass die Überprüfung auf Die PCR-Inhibition ist Teil der Grundlage einer guten eDNA-Arbeit [2].

Plattform Kern II: Optimales Umfragedesign

Der zweite Kern der TripleLock™ Plattform ist die Bereitstellung optimaler Erhebungsdesigns, um die Wahrscheinlichkeit der Entdeckung einer Zielart zu maximieren. Es ist weithin bekannt, dass die Verteilung der eDNA nicht homogen ist und von mehreren Variablen abhängt, darunter Artenökologie, Wasserqualität, pH-Wert und Trübung, um nur einige zu nennen. Aus diesem Grund ist es so wichtig, die Ökologie der eDNA zu verstehen und zu wissen, wie man am besten Proben dafür nimmt. Unsere Plattform vereint optimale Probenahmepläne mit ausgeklügelten Probenahmeverfahren, um eDNA-Erhebungen mit höchster Zuverlässigkeit durchzuführen.

Wir berücksichtigen die kritischen Umweltvariablen, Biologie und Ökologie der Arten sowie standortspezifische Erwägungen, die direkt mit zum Zweck der Studie. Beim Präzisionsbiomonitoring verwenden wir eine proprietäre Methode auf der Grundlage statistischer Analysen, einschließlich der Modellierung der Lebensraumbelegung, um die Optimalität der Stichprobenziehung für eine bestimmte eDNA-Umfrage zu bestimmen. Wir sind derzeit Entwicklung eines Software-Tools (Patent angemeldet), das eine maßgeschneiderte Umfrage ermöglicht Designs, die auf den aktuellsten verfügbaren eDNA-Daten basieren. Dieses Erhebungsdesign Tool fügt unserem Arbeitsablauf eine weitere Ebene der Konsistenz und Standardisierung hinzu.

Die Grundlage eines guten Beprobungsplans ist zunächst einmal die Art und Weise, wie die Proben gesammelt werden. Unsere Feldprobenahmeverfahren sind im Vergleich zu anderen Angeboten weitaus fortschrittlicher. Für das Präzisionsbiomonitoring wird der Probenentnahmerucksack von ANDe™ verwendet, das erste speziell angefertigte aquatische eDNA-Probenentnahmesystem [4]. Der ANDe™ bietet eine größere Vielseitigkeit bei der Probenahme und ermöglicht uns eine effektivere Probenahme in der Tiefe, über Transekte hinweg, mit erhöhtem Durchsatz und höheren Wasservolumen. Beispielsweise können wir mit dem ANDe™ System sehr einfach Proben für Arten nehmen, die typischerweise auf dem Boden eines Sees in 30 Fuß Tiefe leben, was die Effektivität einer solchen Untersuchung erheblich steigert. Dies ist etwas, was nicht mit kleinen Plastikflaschen zur Beprobung von Oberflächenwasser durchgeführt werden kann, eine Praxis mit geringer Genauigkeit, die von anderen in der Branche angeboten wird. Unsere Methoden zur Gestaltung des Umfragedesigns zusammen mit unseren fortschrittlichen Stichprobentechniken ermöglichen es uns, eDNA-Umfragen durchzuführen, die anderen in der eDNA-Branche überlegen sind.

Plattform Kern III: Vor-Ort-Erkennung

Der dritte Kern der Plattform TripleLock™ ist die Vor-Ort-Detektion, die es uns ermöglicht, schnelle Ergebnisse vor Ort zu erzielen. Die Vor-Ort-Detektion vereint mehrere Komponenten unserer Feldprobenahmeverfahren, darunter das Filtrationssystem ANDe™ sowie die DNA-Extraktion vor Ort und die qPCR-Analyse. Die Vorteile der Vor-Ort-Detektion kommen dann zum Tragen, wenn die Gewinnung von Ergebnissen zeitkritisch ist und eine Entscheidung ansteht. Mit Hilfe des Biomeme-eDNA-Probenvorbereitungskits und Biomeme Three9™, einem tragbaren qPCR-Gerät, können wir Ergebnisse vor Ort erhalten und sie über die eingebaute Datenkonnektivität schnell an einen Entscheidungsträger übermitteln. Das bedeutet, dass wir nicht auf Proben warten müssen, die transportiert und in einem zentralen Labor analysiert werden müssen. Ein weiterer Vorteil dieser Methoden besteht darin, dass wir durch Filtern, Extrahieren und Eluieren der DNA in einen pH-Wert und einen thermostabilen Puffer vor Ort das Potenzial für eine Probendegradation während des Transports minimieren und so die Möglichkeit falsch negativer Ergebnisse verringern.

Die Beseitigung des Potenzials zur Probenzersetzung ist eine inhärente Vorteil unserer Feldmethoden im Vergleich zu Methoden, die von anderen angeboten werden. Durch durch schnelle Extraktion von DNA aus einem Filter in einen stabilen Puffer bewahren wir diese wertvolle Fragmente von eDNA für die Analyse.

Es gibt mehrere eDNA-Analyseunternehmen, die Folgendes anbieten Probenahme-"Kits", bestehend aus Plastikflaschen, die zum Greifen eines kleinen Oberflächenprobe, die dann vor jeder Analyse den ganzen Weg zurück zu einem Labor geschickt werden muss kann beginnen. Die Verwendung von handgehaltenen Plastikflaschen bringt den Techniker genau dorthin, wo Sie müssen Proben entnehmen, was zu Störungen im Wasser führt und das Potential für die Übertragung von Schadstoffen durch diesen Techniker zwischen den Probenahmen Punkte, ganz zu schweigen von der Kontamination, die von der nassen Außenseite einer Flasche herrührt. Durch die Verwendung des Systems ANDe™ ermöglichen wir unseren Technikern eine Reichweite von bis zu 3,6 Metern. von dem Punkt an, an dem die Probe entnommen wird, und enthalten unsere Probe in einer geschlossene und sterile Einweg-Filterpatrone, die die Potential für Kontamination.

Neben den gravierenden Nachteilen, die sich daraus ergeben, dass beschränkt auf Oberflächenproben aufgrund der Verwendung von Flaschen, anderer Nachteile und Bedenken ergeben sich aus dem Transport von Wasserproben zurück zu einem Labor zur Analyse. Der Transport von Wasserproben eröffnet der eDNA bedeutende Möglichkeiten erniedrigen. Der Transport von Wasserproben auf Eis kann die Degradation potenziell verringern. aber nicht beseitigt. Darüber hinaus sind Verzögerungen beim Versand, insbesondere während warmes Wetter, machen das Kalthalten von Wasserproben logistisch schwierig und Zeiten unmöglich. Durch Extraktion und Analyse der DNA vor Ort entfernen wir die Potential für den Zerfall der DNA und die Beseitigung dieser bedeutenden logistischen Herausforderungen.

Zusätzlich durch Minimierung des DNA-Abbaues eliminieren wir die Bedarf an überflüssigen, mehrdeutigen und kostspieligen zusätzlichen qPCR-Tests für so genannte vollständig lebensfähige eDNA. Diese Tests basieren häufig auf Pflanzen-/Algen-DNA. Pflanze/Algen Zellen von elastischen Zellwänden umgeben sind, die eine osmotische Lyse verhindern, aber tierische Zellen sind es nicht. Theoretisch bedeutet dies, dass mehr pflanzliche/algene DNA im Inneren von Zellen konserviert, die vor der eDNA-Extraktion auf Filtern aufgefangen wurden, während Zellen leicht ihre Integrität verlieren und DNA freisetzen, so dass sie im Vergleich weniger langlebig ist zu pflanzenbasierter eDNA. Rückschlüsse auf die Integrität eines Zieltieres Arten-DNA, die auf den Ergebnissen eines pflanzenbasierten Tests basieren, sind wahrscheinlich Verdächtiger. Darüber hinaus sind Tests auf die gesamte eDNA einer Familie von Organismen, die alle auf Beispiel, sind ebenfalls überflüssig. Die Ziel-DNA kann in extrem geringer Menge vorhanden sein im Vergleich zur gesamten eDNA, die in einigen Fällen > 0,0004% der gesamten eDNA ausmachte [5]. Theoretisch liefern Tests auf Gesamt-eDNA von Fischen oder Amphibien höchstwahrscheinlich keine sachdienliche Informationen über die Integrität der eDNA einer einzelnen Zielart, insbesondere in Fällen, in denen Proben von einer isolierten Stelle oder Tiefe entnommen werden, wo andere Organismen in einer Familie nicht bewohnen dürfen. Ein theoretisches Beispiel für einen solchen Fall ist wenn ein anthropogen gebauter Lebensraum, d.h. ein sanierter Fluss, beheimatet ist auf nur wenige ausgewählte Pionier- oder wiedereingeführte Arten. In diesen Fällen ist ein Test für die gesamte Fisch-eDNA kann als falsch-negativ interpretiert werden, da Fülle, nicht geringe Integrität.

Die Plattform TripleLock™ für Präzisionsbiomonitoring führt zusammen mehrere Aspekte der Molekularbiologie, des Designs von Umweltumfragen und Stichproben und führende Innovationen zur Erstellung von eDNA-Erhebungen nach dem Goldstandard. Die Die Entwicklung unserer Plattform ist in den Best Practices für eDNA-Umfragen verankert sowie Standards wie die MIQE-Richtlinien, die die Präzision Biomonitoring ein Branchenführer für eDNA-Erhebungen.

Referenzen:

1. Wilcox TM, Carim KJ, Young MK, McKelvey KS, Franklin TW, Schwartz MK. Kommentieren: Die Bedeutung des Klangs Methodik bei der Entnahme von DNA-Proben aus der Umwelt. Nord Am J Fischverwaltung. 2018; 1–5. doi:10.1002/nafm.10055

2. Goldberg CS, Turner CR, Deiner K, Klymus KE, Thomsen PF, Murphy MA, u.a. Kritische Überlegungen für die Anwendung von DNA-Methoden aus der Umwelt zum Nachweis aquatischer Arten. Methoden Ecol Evol. 2016;7: 1299-1307. doi:10.1111/2041-210X.12595

3. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, et al. Die MIQE-Richtlinien: Mindestens Informationen zur Veröffentlichung von quantitativen Echtzeit-PCR-Experimenten. Klinik Chem. 2009;55: 611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797

4. Thomas AC, Goldberg CS, Howard J, Nguyen PL, Seimon TA, Thomas AC. ANDe TM :Eine vollständig integrierte System zur Entnahme von DNA-Proben aus der Umwelt. 2018;2018: 1379–1385. doi:10.1111/2041-210X.12994

5. Turner CR, Barnes MA, Xu CCY, Jones SE, Jerde CL, Loge DM. Partikelgrößenverteilung und optimale Erfassung von wässrige makrobiale eDNA. Gilbert M., Herausgeber. Methoden Ecol Evol. 2014;5: 676-684. doi:10.1111/2041-210X.12206

Erforschung MIQE-ähnlicher Standards für qPCR-basierte molekulare Detektion von eDNA

Erforschung MIQE-ähnlicher Standards für qPCR-basierte molekulare Detektion von eDNA

In der vorhergehenden Blog berichteten wir kurz über die MIQE-Standards - Richtlinien zur Förderung der minimale Standards für die Berichterstattung über qPCR-Daten aus klinischen Studien, die zum Nachweis kleiner relativer Veränderungen in der Genexpression verwendet werden innerhalb von Zellen oder Geweben oder zur Quantifizierung der Menge des/der Erreger(s). So viel von zeitgemäße DNA-Arbeit im Umweltbereich mit Hilfe von qPCR-Ansätzen durchgeführt wird, ist es nur sinnvoll, dass ähnliche Standards für die eDNA-Arbeit entwickelt werden, das sollte - es wird argumentiert werden - über das hinausgehen, was für klinische Anwendungen akzeptabel ist.

Dies ist etwas einer Umkehrung der Konvention in wissenschaftlichen Kreisen, wie es normalerweise der Fall ist dass klinische Anwendungen eine erhöhte Beweislast benötigen, um jede Schlussfolgerungen aus experimentellen Daten gezogen. Aufgrund der Ökologie der eDNA, ihre Verteilung in natürlichen Systemen mit unzähligen potenziellen Quellen für Generation und Zerfall, verbunden mit der hierarchischen Natur ihrer Stichproben, glaube ich eDNA stellt einen Sonderfall dar, bei dem strengere Standards angewandt werden sollten als klinischen Einstellungen, so dass das Vertrauen in unsere Ergebnisse vertrauenswürdig ist.

Was sind die Hauptunterschiede bei der Verwendung von qPCR zum Nachweis von Veränderungen in der Genexpression oder viralen Last, zum Beispiel bei der Verwendung von qPCR zum Nachweis von eDNA? Abbildung umreißt die Arbeitsablauf für A) die Durchführung einer Genexpressions-qPCR-Analyse neben B) a generischer eDNA-Workflow. In A) hat ein Untersucher eine Gewebeprobe, innerhalb die einen garantierten Nukleinsäuregehalt aufweisen. Stellen Sie sich vor, sie wollen testen für die Expressionsniveaus eines Gens, von dem angenommen wird, dass es eine positive Rolle bei der Linderung von Stress in Pflanzen, die einem Umweltstress ausgesetzt sind. In Bei solchen Studien werden die Expressionswerte mit sogenannten Referenzgenen verglichen, die immer exprimiert werden, so dass jede Veränderung des Zielgens nach Normalisierung der Expressionsniveaus verglichen. Obwohl Pflanzen in einer Kontrolle Plot wenig Expression des Zielgens zeigen sollte, wäre es immer noch voraussichtlich, wenn auch in reduzierten Mengen, im Pflanzengewebe gefunden werden, das Nukleinsäure-Extraktionen (in diesem Fall die Messenger-RNA, die in DNA (komplementäre DNA oder cDNA)) in einem Prozess, der reverse Transkription genannt wird, so dass das Ziel für eine DNA-basierte qPCR zugänglich ist. Als solches erwartet man eine Menge cDNA, wenn sie mit Standard-Laborgeltechniken visualisiert würde. Dort wird immer eine viel stärkere - und stabilere - Expression des Referenzgens mRNA, und durch Erweiterung cDNA. Kurz gesagt: Es gibt eine zuverlässige Quelle für cDNA, die die Vorlage für die qPCR-Assays sowohl für das Zielgen als auch für die Referenzgen(e).

Generische Arbeitsabläufe zur Durchführung von A) Genexpressions-qPCR und B) eDNA-qPCR

Überlegen Sie es sich dann, Umwelt-DNA. Lässt man die komplexe Ökologie der eDNA einmal beiseite (vorbehaltlich eines weiteren Blog-Eintrags, aber siehe ausgezeichnete Rezension von Barnes und Turner [2]), die Verteilung von eDNA in einem Wasserkörper weitgehend ephemer ist und bei weitem nicht Konzentrationen, ohne Garantie, dass die Probenahme DNA-Moleküle oder Zelltrümmer in Probenahmeröhrchen oder auf Filterpapiere. Es gibt eine bedeutende Quelle für Beobachtungsfehler in diesem Stadium, die weitgehend die in Genexpressionsstudien fehlen, obwohl beide Verfahrensfehler teilen, die kann den Erfolg der nachgeschalteten qPCR beeinflussen. Abhängig von Faktoren wie dem Volumen des beprobten Wassers und der Porengröße der Filter, die Menge der gesamten eDNA kann erheblich variieren, obwohl sie, wenn sie auf einem Gel visualisiert wird, weniger wahrscheinlich so viel Target enthält, wie aus Gewebe extrahierte mRNA in cDNA umgewandelt wurde.

qPCR durchführen für entweder A) oder B) erfordert die Einnahme einer Menge an Gesamt-cDNA oder Gesamt-eDNA für als Vorlage für die Reaktionen verwenden. Die Wahrscheinlichkeit der Unterprobenahme dieses Extrakts und nicht erkannt zu werden, ist für eDNA höher, da die extra seltene Ziel sowohl in der Wasserprobe - die möglicherweise überhaupt nicht gesammelt wurde - und durch die relative Seltenheit des Zielmoleküls in der Suppe der gesamten eDNA Moleküle. Für eDNA haben wir zwei Unsicherheiten bei der Probenahme aufgrund der beiden Probenahmeereignisse - des Wasserkörpers und der gesamten eDNA - die dazu beitragen, den zugrunde liegenden statistischen Fehler zu vergrößern.

Unterm Strich: eDNA muss empfindlichere und wohl auch spezifischere Assays annehmen als klinische Anwendungen. Spezifischer? Nun, während sich viele Gene während Entwicklung durch Duplizierung und anschließende Divergenz, diese Ereignisse sind auf Genfamilien lokalisiert sind, so dass bei der Entwicklung eines qPCR-Tests für ein Gen mit eine Reihe von evolutionär ähnlichen Orthologen und Paralogen, das Nukleotid Divergenz zwischen diesen Genen und allen anderen im Genom eines einzelnen Gewebes Typ ist riesig, eine dn also unspezifische Amplifikation eines Nicht-Zielgens abgeschwächt. Wenn jedoch ein eDNA-Marker verwendet wird, kann derselbe DNA-Abschnitt (z.B, COI-Locus) in allen Nicht-Zielorganismen vorhanden, da er von einem gemeinsamen COI-Locus geerbt wurde. Vorfahre. Die Evolution wird jedoch die Anzahl der Nukleotidunterschiede erhöhen. zwischen den Arten im Laufe der Generationen. Neuere divergierende Taxa können jedoch nicht genügend Variation zwischen den Arten aufweisen, um einen geeigneten Test zu entwerfen - aber sehen Sie sich den vorherigen Blog für eine eingehende Behandlung von Assay-Design und -Ziel Spezifität.

In der nächsten Blog werde ich genau besprechen, wie wir LOD, LOQ schätzen - weitere Annahme von MIQE Standards - und wie wir einen Assay so optimieren, dass er sich für eine strenge, wiederholbare und reproduzierbarer eDNA-Assay. Dazu müssen wir nicht nur das Target optimieren, sondern auch Faktoren identifizieren und berücksichtigen, die Varianz in das System einbringen, ruchlosesten PCR-Inhibitoren. Ich werde beschreiben, wie wir MIQE-ähnliche Anleitungen verwenden und synthetische interne positive Kontrollelemente zur Bestimmung der Zuverlässigkeit der eDNA-Ergebnisse. Wir werden auch in Zukunft diskutieren, wie die Ökologie von eDNA und die Assay-Leistung in Pilotversuchen zur Optimierung des Nachweises genutzt werden kann (und die potenzielle Quantifizierung) von gezielten eDNA-Nachweisstudien.

1] Bustin et al. (2009). Die MIQE-Richtlinien: Mindestinformationen für Veröffentlichung von qPCR-Experimenten. Klinische Chemie 55, doi.org/41373/clinch.2008.112797.

2] Barnes und Turner (2016). Die Ökologie der Umwelt-DNA und Auswirkungen auf die Erhaltungsgenetik. Erhaltungsgenetik, 17, 1-17.

3] Doi et al. (2017). Umwelt DNA-Analyse zur Abschätzung des Vorkommens und der Biomasse von Flussfischen. Süßwasserbiologie, 62, doi.org/10.1111/fwwb.12846.

 4] Nevers et al. (2018). Umwelt-DNA (eDNA): ein Werkzeug zur Quantifizierung der reichlich vorhandenen, aber schwer fassbaren runden Grundel (Neogobius melanostomus). PLoS Eins, 13, doi.org/10.1371/Zeitschrift.pone.0191720.

5] Evans et al. (2016). Quantifizierung der Artenvielfalt von Fischen und Amphibien im Mesokosmos mittels eDNA Metabarcodierung. Molekulare Ökologie Ressourcen, 16, doi/10.1111/1755-0998.12433.

6] Hunter et al. (2016). Nachweisgrenzen von quantitativen und digitalen PCR-Assays und deren Einfluss bei Anwesenheit-Abwesenheit Erhebungen zu eDNA. Molekulare Ökologie Ressourcen, 17, doi/10.1111/1755-0998.12619.

7] Forootan et al. (2017). Methoden zur Bestimmung der Nachweis- und Quantifizierungsgrenze in quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR). Biomolekulare Detektion Quantifizierung, 12, 1-6.

***cDNA vs. eDNA (Diagramm der Herstellung und Erkennung)? - weitgehend deterministischer Bereich von Signal vs. stochastisches ephemeres Signal; # Orthologe/Paraloge intragenomisch vs. interspezifisch; Ziele sind konstant innerhalb der Zellen vs. ephemer und zeitlich-räumliche Verteilung der Arten und Prädiktoren der Abwurfrate und eDNA-Zerlegung in Ökosystemen. ***

Detektieren von eDNA - Die Bedeutung von Assay-Spezifität und -Sensitivität Teil I: Eine Einführung in die MIQE-Richtlinien und die Generierung und Kuration von DNA-Sequenzdatenbanken für das qPCR-Assay-Design

MIQE - eine kurze Einführung

Im Jahr 2009 kodifizierten Bustin und Kollegen[1 ] eine Reihe von Mindestanforderungen für die Veröffentlichung von quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktions-Daten (qPCR), die angeblich für den Einsatz in den Bereichen klinische Medizin und Molekularbiologie bestimmt sind, um strenge Datensätze zu gewährleisten, die es den Forschern ermöglichen, subtile Veränderungen in der Expression bestimmter Gene oder bei der Abschätzung der Viruslast zu quantifizieren. In Genexpressionsstudien müssen fraktionierte Veränderungen in der Produktion intrazellulärer Botenmoleküle, so genannter mRNAs, die die in den Genen kodierte genetische Information in ihre proteinartige oder endgültige Form übertragen, wahrgenommen werden, um entscheidende Hypothesen von physiologischer, medizinischer und sogar evolutionärer und ökologischer Bedeutung zu prüfen. Bustin et al. sprechen einige der minimalen obligatorischen Standards an, über die berichtet werden muss, um weiterhin einen robusten Nachweis von Nukleinsäuren in niedrigen Konzentrationen zu gewährleisten. Diese Standards wurden als MIQE-Richtlinien bezeichnet: Mvorläufig Informationen für die Veröffentlichung von Quantitative PCR Experimente.

Wir werden diese Richtlinien und ihren Vergleich mit den eDNA-Standards in zukünftigen Stellen diskutieren, aber vorerst werden wir den Hauptunterschied zwischen den Studien, die sich auf MIQE berufen, und denen, die eine Quantifizierung der Umgebungs-DNA mittels qPCR beinhalten, bekannt geben: dass die Konzentrationen von eDNA, je nach den Umständen, unter denen sie gesammelt wird, wahrscheinlich mehrere Größenordnungen niedriger sind als viele beobachtete Veränderungen im Niveau der mRNA-Expression oder der absoluten Mengen an viralen Genomen, die in Geweben vorhanden sind. Infolgedessen müssen wir die MIQE-Standards modifizieren, um sicherzustellen, dass eDNA-Erhebungen vor dem Vorwurf zu laxer Standards geschützt werden, die zu einem signifikanten Auftreten von Fehlern der Typen I und II (falsch positive bzw. negative Ergebnisse) führen können. Wie schon bei der alten DNA (aDNA) muss auch der eDNA-Nachweis diese Standards auf ein höheres Niveau heben, da die Zielmoleküle in natürlichen Systemen sehr viel flüchtiger sind.

Die Bedeutung von Spezifität und Sensitivität

Gemeinsam mit aDNA und biomedizinischen Anwendungen von qPCR-Assays besteht eine wesentliche Abhängigkeit von zwei Prüfsteinen molekular-basierter Nachweise: Spezifität (oder: wie hoch ist die Wahrscheinlichkeit, ein Nicht-Ziel falsch zu detektieren, was zu Typ-I-Fehlern führen kann, wenn es nicht ganz spezifisch für das/die Ziel(e) ist?) und Sensitivität (oder: wie hoch ist die Wahrscheinlichkeit, extrem niedrige Konzentrationen der Zielspezies zu detektieren, was, wenn nicht quantifiziert, zu Typ-II-Fehlern führen kann?)[2]. Der allererste Schritt zur Minimierung dieser potentiellen Fehlerquellen besteht darin, extrem robuste Assays in silico zu entwerfen, was entscheidend davon abhängt, dass man über substantielle genomische Daten von Ziel- und sympatrischen (mitverteilten) Nicht-Zielorganismen verfügt, mit denen man hochgradig diskriminierende Assays entwerfen kann. Um dies zu erreichen, ist die genomische Information von größter Bedeutung; man muss eine bedeutende Menge an genetischer Sequenzinformation sammeln und kuratieren.

Information ist der Schlüssel - Eine evolutionäre und bevölkerungsgenetische Begründung für die Datengenerierung und -kuration

Wie viel genomische Information ist genug? Und wie können wir ein hohes Maß an genetischer Variation innerhalb einer Spezies und ein geringes Maß an genomischer Sequenzdivergenz zwischen nahe verwandten, Schwester- und/oder kryptischen Spezies erklären? Alles ausgezeichnete Fragen, und jede muss zufriedenstellend beantwortet werden, oder man kann nicht mit gutem Gewissen einen generischen Test für die betreffende Zielart veröffentlichen oder zur Verfügung stellen.

Coda

In diesem Beitrag haben wir das Sammeln und Kuratieren von Daten für die Entwicklung eines artspezifischen Assays, der generell im gesamten Verbreitungsgebiet einer Art oder zumindest in den Populationen, aus denen Sequenzdaten generiert wurden, eingesetzt werden soll, ausführlich diskutiert. Hier bei PBI entwickeln wir auch neue Wege, um selbst extrem nahe verwandte Arten mit geringer Nukleotid-Variation auseinander zu reizen. In ähnlicher Weise hoffen wir auch, populationsspezifische Assays zu entwickeln, die möglicherweise auf einzelne evolutionär bedeutsame Einheiten (ESUs) und Management- oder Erhaltungseinheiten (M/CUs) abzielen können[9].

Im nächsten Blog werden wir die erforderlichen Mindeststandards für einen zuverlässigen, robusten und seriösen eDNA-qPCR-Assay weiterentwickeln und darlegen, wie diese Anforderungen die der MIQE-Richtlinien erweitern und verschönern. Wir werden die Begriffe LOD (Limit of Detection) und LOQ (Limit of Quantification) etwas ausführlicher behandeln und fragen: Welches sind die entscheidenden Parameter (CARP) für das Design, die Optimierung und die Validierung von eDNA-Assays?

1 ] Bustin et al. (2009). Die MIQE-Richtlinien: Mindestinformationen für die Veröffentlichung von qPCR-Experimenten. Klinische Chemie 55, doi.org/41373/clinch.2008.112797.

2] Lahoz-Monfort et al. (2015). Statistische Ansätze zur Berücksichtigung falsch-positiver Fehler in DNA-Proben aus der Umwelt. Ressourcen der Molekularen Ökologie, 16, doi: 10.1111/1755-0998.12486.

[3] Hale et al. (2012). Probenahme für mikrosatellitengestützte populationsgenetische Studien: 25 bis 30 Individuen pro Bevölkerung reicht aus, um die Allelhäufigkeiten genau abzuschätzen. PloS One, doi: 10.1371/Zeitschrift.pone/0045170

4 ] Luo et al. (2018). Biparentale Vererbung mitochondrialer DNA beim Menschen. Proceedings of the National Academy of Sciences, doi: 10.1073/pnas.1810946115

[5] Benasson et al. (2001). Mitochondriale Pseudogene: die unangebrachten Zeugen der Evolution. Trends in Ökologie und Evolution, 16, 314-321.

6] Smith & Smith (1996). Synonyme Nukleotid-Divergenz: Was ist "Sättigung"? Genetik, 142, 1033-1036.

7] Felsenstein J (2003). Inferring Phylogenies, Sunderland (Sinauer).

8] Crête-Lafrenière et al. (2012). Umrahmung des phylogenetischen Porträts der Familie Salmonidae: ein vollständigeres Bild aus einer verstärkten Taxon-Stichprobe. PloS One, doi: 10.1371/Zeitschriftpone.0046662.

9] Palsbøll et al. (2006). Identifizierung von Bewirtschaftungseinheiten mit Hilfe populationsgenetischer Daten. Trends in Ökologie und Evolution, 22, 11-16.

Verwendung von Umwelt-DNA (eDNA) zur Überwachung aquatischer Ökosysteme

Die Überwachung der DNA in der Umwelt - eDNA - steht an der Spitze einer neuen Welle technologisch fortschrittlicher Überwachungsbemühungen. Die eDNA hat ihre Wurzeln in der Boden- und Paläoökologie und wurde erstmals 2008 in einer bahnbrechenden wissenschaftlichen Arbeit von Ficetola et al. zum Nachweis eines mehrzelligen aquatischen Organismus - des invasiven amerikanischen Ochsenfrosches Lithobates catesbeianus -verwendet[1]. Durch Anwendung der weit verbreiteten, jedoch hochempfindlichen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) - einer Reaktion, die eine spezifische DNA-Sequenz in einer Probe nur dann "amplifiziert" , wenn die DNA der Spezies in noch so geringer Menge vorhanden ist - konnten Ficetola und Kollegen die DNA der Frösche in dem aus der Wassersäule herausgefilterten Sediment nachweisen. Um zu verstehen, warum das so ist, wird eine aktuelle Arbeitsdefinition von eDNA - die von den meisten Ökologen übernommen wurde - erhellen: eDNA ist "...genetisches Material, das direkt aus Umweltproben (Boden, Sediment, Wasser usw.) ohne offensichtliche Anzeichen von biologischem Ausgangsmaterial gewonnen wird" (Thomsen & Willerslev 2015[2]). Beispiele dafür, wie eDNA von einem Organismus ausgeschieden wird - hier z.B. von der Mittellandschildkröte Chrysemys picta - sind in der Abbildung unten dargestellt.

Blog-Bild 1

In der Abbildung werden DNA-haltige Zellen ständig oder periodisch von der inneren Auskleidung des Darms der Schildkröte, dem Fortpflanzungssystem, durch Regurgitation der Nahrung, den Ersatz von Hautzellen und Schleim, den Austritt von Abfallstoffen und durch die Freisetzung von Geschlechtszellen (d.h. Sperma und Eizellen) abgestoßen. Einmal im Wasser, ist die DNA innerhalb der Zellen einigermaßen geschützt. Schließlich werden die Zellen abgebaut, und die DNA wird in das wässrige Milieu freigesetzt, wo sie sich dann in Lösung befindet. Obwohl die eDNA durch eine Reihe biologischer, chemischer und physikalischer Prozesse abgereichert wird, wird sie immer wieder aufgefüllt , wenn der Organismus noch in der Nähe lebt. Das heisst, das Signal der eDNA wird umso stärker sein, je näher sie sich in der Nähe ihrer Quelle befindet, und es wird sich auch verstärken, wenn es mehr Individuen in einer lokalen Bevölkerung gibt, wenn die Wassermenge gleich bleibt. Daher kann ein eDNA-Signal ein zuverlässiger Indikator für die Präsenz der Zielart in einem bestimmten Lebensraum sein.

Was sind die Hauptvorteile der eDNA-Überwachung? Zunächst einmal ist es nicht notwendig, die Spezies physisch zu beproben, wodurch die mit der gezielten Überwachung von stressempfindlichen Lebewesen verbundenen Störungen minimiert werden. Da zudem nur Wasserproben entnommen werden und nur wenige Menschen, wird der mit dem Monitoring an sich verbundene ökologische Fußabdruck verringert. Da die PCR ein hochempfindlicher molekularbiologischer Assay ist, haben eDNA-Untersuchungen tendenziell eine viel höhere Sensitivität, um seltene oder kryptische Spezies nachzuweisen, als herkömmliche Methoden (z.B. Schmelzle & Kinziger 2016[3]). Infolgedessen sind artspezifische eDNA-Untersuchungen potenziell auch wesentlich kostengünstiger als herkömmliche Verfahren. Darüber hinaus kann jeder eine Wasserprobe entnehmen, indem er einfache Anweisungen befolgt, wodurch wissenschaftliche Projekte von Bürgern auf der ganzen Welt demokratisiert und erleichtert werden. In der Tat basiert die aktuelle Palette von Unternehmen, die eDNA-Nachweisdienste anbieten, auf einem Modell von Wasserproben, die von Laien und technischem Personal entnommen und in einem zentralen Labor weiterverarbeitet werden.

Da eDNA jedoch eine im Entstehen begriffene Technologie ist, besteht Unsicherheit über einige der Schlussfolgerungen, die aus frühen eDNA-Studien gezogen wurden. Diese Fragen (d.h. die "Fehlerquellen") werden jedoch von Wissenschaftlern, auch hier bei Precision Biomonitoring, laufend untersucht, um ihre Auswirkungen zu minimieren. Daher müssen alle potenziellen Fehlerquellen, so wie sie derzeit verstanden werden, anerkannt und in jede technische Entwicklung (d.h. Design, Produktion und Validierung artspezifischer PCR-Assays) oder Standardarbeitsprotokolle für Felduntersuchungen einbezogen werden. Beispielsweise können sich Organismen während ihrer gesamten Lebensdauer bewegen. Es hat sich gezeigt, dass die Saisonalität ein starker Faktor für den Erfolg des eDNA-Nachweises ist (de Souza et al. 2016[4]). Es ist unerlässlich, dass die Erhebungen mit einer gründlichen Kenntnis der Ökologie einer Art durchgeführt werden, einschliesslich der Einsicht in die aktuellen Verbreitungsgebiete und Habitatpräferenzen, da andernfalls eine unzulängliche Erhebung zu einem falsch negativen Ergebnis führt, d.h. die Schlussfolgerung, dass ein Ziel abwesend ist, wenn es tatsächlich vorhanden ist; nur unentdeckt. Die Nichtberücksichtigung falsch negativer Ergebnisse kann schwerwiegende finanzielle Auswirkungen haben, wenn Infrastrukturprojekte in der Folge gestoppt, auf Eis gelegt oder aufgegeben werden, weil ein unerschrockener Ökologe oder ein Mitglied der Öffentlichkeit das Ziel wiederentdeckt hat. Falsch-negative Ergebnisse können auch die Folge einer unsachgemäßen Assay-Entwicklung, der Unterschätzung der genetischen Vielfalt innerhalb der Spezies an PCR-Amplifikationsstellen und des derzeitigen unzusammenhängenden Verfahrens sein, mit dem eDNA-Proben von der Mehrheit der eDNA-Praktiker verarbeitet werden.

Wie bereits erwähnt, zerfällt eDNA, wenn sie natürlichen Prozessen ausgesetzt wird. Daher besteht für die gesammelte eDNA das Risiko des Zerfalls nach der Entnahme, da es keinen Mechanismus zur Wiederauffüllung des Sammelgefäßes mit eDNA gäbe, wodurch das eDNA-Signal reduziert würde und möglicherweise kein positives PCR-Ergebnis erzielt werden könnte. Daher ist das Risiko eines eDNA-Abbaues während der Probenahme - insbesondere an heißen, sonnigen Tagen - und auf dem Weg vom Feld ins Labor hoch signifikant. Unsachgemäße Lagerung kann ebenfalls eDNA zerstören (z.B. kann die Wasserkristallbildung beim Einfrieren DNA-Moleküle "zerfetzen"). Um den Status quo noch weiter zu verschärfen, besteht trotz der besten Bemühungen zeitgenössischer Laboratorien weiterhin ein erhebliches Risiko falsch positiver PCR-Ergebnisse, die durch den Transport von aerosolisierten DNA-Partikeln zwischen den Labors innerhalb der Gebäude durch Lüftungswege vermittelt werden. Die meisten eDNA-Praktiker versuchen, die Verarbeitung von eDNA-Proben (z.B. Filterpapiere oder gefällte Wasserproben) mit nachgeschaltetem PCR-Nachweis physikalisch zu trennen, aber selbst das ist alles andere als idiotensicher.

Hier bei Precision Biomonitoring werden wir eine hochmoderne Plattform vorstellen, die versuchen wird, diese Quellen von eDNA-Analyse- und Probenahmefehlern zu eliminieren oder zu minimieren, und zwar durch die Beseitigung von Transitphasen zu einem zentralen Labor und die Anwendung von Standardarbeitsanweisungen. Darüber hinaus werden wir die Sache eines demokratisierten Biomonitoring-Bereichs fördern, in dem für die Durchführung anspruchsvoller PCR-basierter artspezifischer Assays kein technisches Spezialgebiet erforderlich ist. Unser System, das maßgeschneiderte PCR-Assays verwendet, wird PCR-eDNA-Ergebnisse in Echtzeit liefern (

Unser Ziel ist es, denjenigen, die im Bereich der Biodiversitätsüberwachung tätig sind (von professionellen Ökologen bis hin zu lokalen wissenschaftlichen Bürgerprojekten), die Möglichkeit zu geben, sehr strenge und potenziell hochgradig koordinierte, gezielte eDNA-Erhebungen durchzuführen, um das weltweite Biodiversitätserbe für alle künftigen Generationen besser zu sichern.

1 ] Ficetola et al. (2008). Spezies-Nachweis mittels Umwelt-DNA aus Wasserproben. Biologie-Buchstaben, 4, 423-425.

2] Thomsen & Willerslev (2015). Environmental DNA - Ein neuartiges Instrument im Naturschutz zur Überwachung der vergangenen und gegenwärtigen Biodiversität. Biologische Bewahrung, 183, 4-18.

3] Schmelzle & Kinziger (2016). Verwendung von Belegungsmodellen zum Vergleich von Umwelt-DNA mit traditionellen Feldmethoden zur Überwachung einer gefährdeten aquatischen Art auf regionaler Ebene. Ressourcen der Molekularen Ökologie, 16, 895-908.

4] de Souza et al. (2016). Die Nachweiswahrscheinlichkeit von DNA (eDNA) in der Umwelt wird von der saisonalen Aktivität der Organismen beeinflusst. PLoS One, doi: 10.1371/Zeitschrift.pone.0165273