Detecting eDNA – The Importance of Assay Specificity and Sensitivity Part I: An Introduction to the MIQE Guidelines and DNA Sequence Database Generation & Curation for qPCR Assay Design

MIQE - eine kurze Einführung

Im Jahr 2009 kodifizierten Bustin und Kollegen[1 ] eine Reihe von Mindestanforderungen für die Veröffentlichung von quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktions-Daten (qPCR), die angeblich für den Einsatz in den Bereichen klinische Medizin und Molekularbiologie bestimmt sind, um strenge Datensätze zu gewährleisten, die es den Forschern ermöglichen, subtile Veränderungen in der Expression bestimmter Gene oder bei der Abschätzung der Viruslast zu quantifizieren. In Genexpressionsstudien müssen fraktionierte Veränderungen in der Produktion intrazellulärer Botenmoleküle, so genannter mRNAs, die die in den Genen kodierte genetische Information in ihre proteinartige oder endgültige Form übertragen, wahrgenommen werden, um entscheidende Hypothesen von physiologischer, medizinischer und sogar evolutionärer und ökologischer Bedeutung zu prüfen. Bustin et al. sprechen einige der minimalen obligatorischen Standards an, über die berichtet werden muss, um weiterhin einen robusten Nachweis von Nukleinsäuren in niedrigen Konzentrationen zu gewährleisten. Diese Standards wurden als MIQE-Richtlinien bezeichnet: Mvorläufig Informationen für die Veröffentlichung von Quantitative PCR Experimente.

Wir werden diese Richtlinien und ihren Vergleich mit den eDNA-Standards in zukünftigen Stellen diskutieren, aber vorerst werden wir den Hauptunterschied zwischen den Studien, die sich auf MIQE berufen, und denen, die eine Quantifizierung der Umgebungs-DNA mittels qPCR beinhalten, bekannt geben: dass die Konzentrationen von eDNA, je nach den Umständen, unter denen sie gesammelt wird, wahrscheinlich mehrere Größenordnungen niedriger sind als viele beobachtete Veränderungen im Niveau der mRNA-Expression oder der absoluten Mengen an viralen Genomen, die in Geweben vorhanden sind. Infolgedessen müssen wir die MIQE-Standards modifizieren, um sicherzustellen, dass eDNA-Erhebungen vor dem Vorwurf zu laxer Standards geschützt werden, die zu einem signifikanten Auftreten von Fehlern der Typen I und II (falsch positive bzw. negative Ergebnisse) führen können. Wie schon bei der alten DNA (aDNA) muss auch der eDNA-Nachweis diese Standards auf ein höheres Niveau heben, da die Zielmoleküle in natürlichen Systemen sehr viel flüchtiger sind.

Die Bedeutung von Spezifität und Sensitivität

Gemeinsam mit aDNA und biomedizinischen Anwendungen von qPCR-Assays besteht eine wesentliche Abhängigkeit von zwei Prüfsteinen molekular-basierter Nachweise: Spezifität (oder: wie hoch ist die Wahrscheinlichkeit, ein Nicht-Ziel falsch zu detektieren, was zu Typ-I-Fehlern führen kann, wenn es nicht ganz spezifisch für das/die Ziel(e) ist?) und Sensitivität (oder: wie hoch ist die Wahrscheinlichkeit, extrem niedrige Konzentrationen der Zielspezies zu detektieren, was, wenn nicht quantifiziert, zu Typ-II-Fehlern führen kann?)[2]. Der allererste Schritt zur Minimierung dieser potentiellen Fehlerquellen besteht darin, extrem robuste Assays in silico zu entwerfen, was entscheidend davon abhängt, dass man über substantielle genomische Daten von Ziel- und sympatrischen (mitverteilten) Nicht-Zielorganismen verfügt, mit denen man hochgradig diskriminierende Assays entwerfen kann. Um dies zu erreichen, ist die genomische Information von größter Bedeutung; man muss eine bedeutende Menge an genetischer Sequenzinformation sammeln und kuratieren.

Information ist der Schlüssel - Eine evolutionäre und bevölkerungsgenetische Begründung für die Datengenerierung und -kuration

Wie viel genomische Information ist genug? Und wie können wir ein hohes Maß an genetischer Variation innerhalb einer Spezies und ein geringes Maß an genomischer Sequenzdivergenz zwischen nahe verwandten, Schwester- und/oder kryptischen Spezies erklären? Alles ausgezeichnete Fragen, und jede muss zufriedenstellend beantwortet werden, oder man kann nicht mit gutem Gewissen einen generischen Test für die betreffende Zielart veröffentlichen oder zur Verfügung stellen.

Coda

In diesem Beitrag haben wir das Sammeln und Kuratieren von Daten für die Entwicklung eines artspezifischen Assays, der generell im gesamten Verbreitungsgebiet einer Art oder zumindest in den Populationen, aus denen Sequenzdaten generiert wurden, eingesetzt werden soll, ausführlich diskutiert. Hier bei PBI entwickeln wir auch neue Wege, um selbst extrem nahe verwandte Arten mit geringer Nukleotid-Variation auseinander zu reizen. In ähnlicher Weise hoffen wir auch, populationsspezifische Assays zu entwickeln, die möglicherweise auf einzelne evolutionär bedeutsame Einheiten (ESUs) und Management- oder Erhaltungseinheiten (M/CUs) abzielen können[9].

Im nächsten Blog werden wir die erforderlichen Mindeststandards für einen zuverlässigen, robusten und seriösen eDNA-qPCR-Assay weiterentwickeln und darlegen, wie diese Anforderungen die der MIQE-Richtlinien erweitern und verschönern. Wir werden die Begriffe LOD (Limit of Detection) und LOQ (Limit of Quantification) etwas ausführlicher behandeln und fragen: Welches sind die entscheidenden Parameter (CARP) für das Design, die Optimierung und die Validierung von eDNA-Assays?

[1] Bustin et al. (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of qPCR experiments. Clinical Chemistry 55, doi.org/41373/clinch.2008.112797.

2] Lahoz-Monfort et al. (2015). Statistische Ansätze zur Berücksichtigung falsch-positiver Fehler in DNA-Proben aus der Umwelt. Ressourcen der Molekularen Ökologie, 16, doi: 10.1111/1755-0998.12486.

[3] Hale et al. (2012). Sampling for Microsatellite-Based Population Genetic Studies: 25 to 30 individuals per population Is enough to accurately estimate allele frequencies.  PloS One, doi: 10.1371/journal.pone/0045170

4 ] Luo et al. (2018). Biparentale Vererbung mitochondrialer DNA beim Menschen. Proceedings of the National Academy of Sciences, doi: 10.1073/pnas.1810946115

[5] Benasson et al. (2001). Mitochondriale Pseudogene: die unangebrachten Zeugen der Evolution. Trends in Ökologie und Evolution, 16, 314-321.

6] Smith & Smith (1996). Synonyme Nukleotid-Divergenz: Was ist "Sättigung"? Genetik, 142, 1033-1036.

7] Felsenstein J (2003). Inferring Phylogenies, Sunderland (Sinauer).

8] Crête-Lafrenière et al. (2012). Umrahmung des phylogenetischen Porträts der Familie Salmonidae: ein vollständigeres Bild aus einer verstärkten Taxon-Stichprobe. PloS One, doi: 10.1371/Zeitschriftpone.0046662.

9] Palsbøll et al. (2006). Identifizierung von Bewirtschaftungseinheiten mit Hilfe populationsgenetischer Daten. Trends in Ökologie und Evolution, 22, 11-16.

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