بلوق

كيف يمكن لeDNA أن تصمد أمام طرق مراقبة الأحياء التقليدية؟

الحمض النووي أو الحمض النووي البيئي يمكن أن يحسن عملية الرصد الحيوي في ثلاث مناطق مركزية بالمقارنة مع أساليب الرصد الحيوي التقليدية التي تنطوي على التكلفة والدقة والوقت. ويسلط الرسم البياني أدناه الضوء على هذه الفوائد الثلاث.

التقليدية مقابل eDNA الكيمون الحيوي
eDNA يساعد على خفض التكاليف، وتحسين الدقة، وتوفير الوقت
اتصل بنا لمعرفة المزيد عن الحمض النووي أو الحمض النووي البيئي.

ميزة ™ الثلاثية

توفر أساليب الحمض النووي (eDNA) البيئية العديد من المزايا عبر أساليب مسح الأنواع التقليدية، وخصوصا عندما نفذت مع الحق في كمية من الخبرة في كل خطوة من خطوات سير العمل. وتشمل هذه المزايا الوقت والتكلفة وفورات، وخصوصا عندما يتم استخدام الكشف في الموقع. عروض eDNA حساسية أعلى وخصوصية الحد من تحيز المراقب مقارنة مع الأساليب التقليدية. eDNA يقلل أيضا من الاضطرابات على الأنواع و الموئل الطبيعي.

على الرغم من أن علم eDNA هو صغير نسبيا، إلا أنه ينضج بسرعة، مع العديد من جوانب تصميم المسح، وطرق أخذ العينات، والتحليل المختبري يتم قبولها كأفضل الممارسات – ومعايير الصناعة في يوم واحد [1، 2]. ومع ذلك، فإن الدراسات الاستقصائية لـ eDNA التي لا تمتثل لمثل هذه المجموعة من أفضل الممارسات يمكن أن تقع بسرعة في فخ ضعف احتمال الكشف والنتائج الخاطئة. في حين أن استطلاعات eDNA يمكن أن تبدو بسيطة نسبيًا لإجراءها ، لا يمكن للمرء ببساطة الاستيلاء على عينة مياه في زجاجة Nalgene والذهاب إلى المختبر ، على أمل تحقيق احتمال الكشف الأمثل أو لديهم ثقة عالية في نتائجها. وتجرى دراسات جودة eDNA مع دراسة متأنية لجميع جوانب تصميم المسح وجمع العينات ومعالجتها.

هنا في شركة Precision Biomonitoring قمنا بتطوير منصة TripleLock™ التي تقوم في جوهرها على أفضل الممارسات المقبولة على نطاق واسع لاستقصاءات eDNA ، مما يضعنا في طليعة صناعة مسح eDNA. إن إجراء عمل قوي في eDNA مهم بشكل خاص في هذه المرحلة المبكرة إذا كان لأساليب eDNA أن تكون مقبولة بحيث يمكن استخدام مزايا eDNA للتقييمات البيئية وبيولوجيا الحفظ في جميع أنحاء العالم. وسيكون التركيز في هذا بلوق لتحديد مزايا منصة TripleLock ™ وكيف يقارنوا إلى أساليب أخرى في هذه الصناعة.

منصة الأساسية 1: TripleLock™ qPCR المقايس

النواة الأولى من منصة الثلاثية ™ تتكون من عالية الجودة، والتحقق بدقة qPCR المقايسات للكشف عن هدف الانواع. في شركة الدقة Biomonitoring لقد تصورنا وطورنا طريقة الملكية للتنمية اختبار صارمة، والذي يسمح لنا باستمرار تصميم والتحقق من صحة الأنواع المحددة وحساسة للغاية qPCR المقايسات. نحن تطوير أسلوبنا الاجتماع وتجاوز الحد الأدنى للمعلومات ل نشر المبادئ التوجيهية الكمية للتجارب PCR في الوقت الحقيقي (MIQE). الـ تحدد إرشادات MIQE العديد من المعايير التي يجب الالتزام بها للحصول على اعتماد موثوق بها وتحاليل qPCR قابلة للتفسير، وبناء منصتنا على أساس هذه معايير صارمة ونحن نضمن نتائج قابلة للتكرار مع التقليل من الأخطاء. لدينا الثلاثية™ كما يتم التحقق من المقايسات مع أعلى مستوى من المعايير الدولية من قبل 3rd مختبر معتمد من طرف ISO 17025. مزايا اتباع موحدة الأساليب واضحة لأنها تنتج الاتساق في النتائج. يجب أن تكون المعايرة يتوافق مع هذه المعايير الصارمة ولا يمكن جمعها ببساطة من مختلف مصادر الأدب و 3 تقرير الطرفالثالث ، لأن ذلك سيؤدي في توحيد غير متناسق عبر الكتالوج.

ونحن نفخر في تطوير لدينا المقايسات الخاصة في المنزل، كما تعارض الحصول على المقايسات المنشورة في الأدب ، لأنه يسمح لنا تحسين عمليات الفحص باستخدام أساليبنا والمعدات الموثوق بها. في حين أن نوعية قد تختلف المقايسات في الأدب eDNA ، يجب على المرء أن يتذكر أن فحص يتكون من أكثر من مجرد التمهيدي ومجموعة التحقيق ، فإنه يشمل بالضبط نوع الكواشف qPCR والأجهزة التي تم التحقق من صحة. هذا يعني أن تكرار حساسية الدقيق من المقالات المنشورة على مختلف يمكن أن تنطوي المعدات على تكاليف إضافية والوقت ، مع الابتعاد عن MIQE المعايير إذا لم يكن يمكن تكرار معلمات الفحص المنشورة في المختبر.

بالإضافة إلى ذلك، تم تصميم لدينا المقايسة مع داخلي التحكم الإيجابي (IPC) للكشف عن تثبيط PCR ، ضرورة مطلقة لتجنب نتائج سلبية كاذبة. يتفق العديد من الخبراء في علم eDNA على أن التحقق من تثبيط PCR هو جزء من أساس العمل الجيد eDNA [2].

منصة الأساسية الثانية: تصميم المسح الأمثل

أما النواة الثانية لمنصة ™ الثلاثي فهي توفر تصاميم مسحية مثالية لتعظيم احتمال الكشف عن الأنواع المستهدفة. ومن المفهوم على نطاق واسع أن توزيع الحمض الهـيائي غير متجانس، ويعتمد على عدة متغيرات منها إيكولوجيا الأنواع، ونوعية المياه، وhH، والعكر، على سبيل المثال لا الحصر. ولهذا السبب فإن فهم البيئة في eDNA، وأفضل طريقة لأخذ عينات لها ، أمر بالغ الأهمية. تجمع منصتنا تصاميم مثالية لأخذ العينات، جنبا إلى جنب مع أساليب أخذ العينات المتطورة لإجراء عمليات المسح eDNA مع أقصى قدر من الثقة.

نحن نأخذ في الاعتبار المتغيرات البيئية الحرجة، علم الأحياء و البيئة الأنواع ، واعتبارات محددة الموقع التي تتصل مباشرة لغرض الدراسة. في الدقة الحيوية نستخدم طريقة الملكية استنادا إلى التحليل الإحصائي، بما في ذلك نمذجة شغل الموائل، إلى تحديد الأمثلية لأخذ العينات لمسح eDNA معين. نحن حاليا تطوير أداة برمجية (براءة اختراع معلقة) تسمح بإجراء مسح مخصص تصاميم على أساس معظم ما يصل إلى تاريخ بيانات eDNA المتاحة. هذا التصميم المسح تضيف الأداة مستوى آخر من الاتساق والمقاييس إلى سير العمل لدينا.

أساس نظام أخذ العينات جيدة هو كيفية جمع العينات لتبدأ. طرقنا لأخذ العينات الميدانية هي أكثر تقدما بكثير مقارنة مع العروض الأخرى. الدقة الحيوية يجعل استخدام ANDe ™ أخذ العينات على ظهره، أول بنيت لهذا الغرض المائية eDNA نظام أخذ العينات [4]. يوفر ANDe ™ زيادة براعة أخذ العينات ، مما يسمح لنا بأخذ عينات أكثر فعالية في العمق ، عبر العناصر ، مع زيادة الإنتاجية ، وأحجام المياه الأعلى. على سبيل المثال، يمكننا أخذ عينات للأنواع التي تتواجد عادة في قاع بحيرة، بعمق 30 قدمًا، بسهولة شديدة باستخدام نظام ANDe™، مما يزيد بشكل كبير من فعالية مثل هذا المسح. وهذا أمر لا يمكن القيام به باستخدام زجاجات بلاستيكية صغيرة لعينة من المياه السطحية، وهي ممارسة منخفضة الدقة يقدمها آخرون في هذه الصناعة. طرق تصميم المسح لدينا جنبا إلى جنب مع تقنياتنا أخذ العينات المتقدمة اسمحوا لنا إجراء استطلاعات eDNA متفوقة مقارنة مع الآخرين في صناعة eDNA.

منصة الأساسية الثالثة: الكشف في الموقع

إنّ المنصة الثالثة لمنصة ™ الثلاثي هي الكشف في الموقع الذي يمكننا من الحصول على نتائج سريعة في هذا المجال. يجمع الكشف في الموقع العديد من عناصر طرق أخذ العينات الميدانية بما في ذلك نظام الترشيح ™ ANDe ، بالإضافة إلى استخراج الحمض النووي في الموقع وتحليل qPCR. مزايا الكشف في الموقع تأتي عندما الحصول على النتائج حساسة للوقت وقرار معلق. من خلال الاستفادة من مجموعة الإعدادية عينة eDNA Biomememe وBiomeme Three9™ ، وهو جهاز QPCR المحمولة ، يمكننا الحصول على نتائج في هذا المجال وتوصيلها بسرعة ، عن طريق بناء اتصال البيانات ، إلى صانع القرار. وهذا يعني عدم الانتظار على العينات ليتم نقلها وتحليلها مرة أخرى في مختبر مركزي. ميزة أخرى لهذه الطرق هو أنه عن طريق تصفية، واستخراج، واستخلاص الحمض النووي في درجة حرارة حرارية ومخزن حراري، في الحقل نحن تقليل احتمال تدهور العينة أثناء العبور، وبالتالي تقليل احتمال وجود السلبيات كاذبة.

إزالة احتمال تدهور العينة هو متأصل الاستفادة من أساليبنا الميدانية مقارنة بالمنهجيات التي يقدمها الآخرون. حسب استخراج بسرعة الحمض النووي من مرشح في المخزن المؤقت مستقرة نحافظ على تلك شظايا قيمة من eDNA للتحليل.

هناك العديد من شركات تحليل eDNA التي تقدم أخذ العينات "مجموعات" تتكون من الزجاجات البلاستيكية التي تستخدم للاستيلاء على صغيرة عينة السطح التي يجب شحنها بعد ذلك على طول الطريق العودة إلى المختبر قبل أي تحليل يمكن أن تبدأ. استخدام الزجاجات البلاستيكية المحمولة يضع الفني الحق حيث انهم بحاجة الى عينة ، مما تسبب في اضطرابات في المياه ، فضلا عن زيادة إمكانية انتقال الملوثات من قبل فني قال بين أخذ العينات نقاط ، ناهيك عن التلوث الناجم عن الخارج الرطب من زجاجة. باستخدام نظام ANDe™، يمكننا تمكين الفنيين لدينا من أن يصل إلى 3.6 متر من النقطة التي يتم أخذ العينة ، وتحتوي على عينة لدينا في المغلقة ومعقمة، واحد استخدام خرطوشة مرشح، والحد إلى حد كبير من احتمالية التلوث.

إلى جانب العيوب الخطيرة التي تنبع من كونها تقتصر على عينات السطح بسبب استخدام الزجاجات، وعيوب أخرى و تنشأ المخاوف من نقل عينات المياه مرة أخرى إلى مختبر للتحليل. نقل عينات المياه يقدم فرصة كبيرة لeDNA إلى تتحلل. نقل عينات المياه على الجليد يمكن أن يقلل من التدهور ولكن لا يلغي ذلك. بالإضافة إلى ذلك، تأخير في الشحن، وخاصة أثناء الطقس الحار، وجعل الحفاظ على عينات المياه الباردة من الصعب لوجستيا وعلى مرات مستحيلة. عن طريق استخراج وتحليل الحمض النووي في هذا المجال نقوم بإزالة احتمال الحمض النووي إلى الاضمحلال ، والقضاء على هذه اللوجستية الهامة التحديات.

بالإضافة إلى ذلك عن طريق تقليل تدهور الحمض النووي نتخلص من الحاجة لاختبارات qPCR زائدة عن الحاجة، وغامضة، ومكلفة إضافية لما يسمى إجمالي eDNA قابلة للحياة. وتستند هذه الاختبارات في كثير من الأحيان على النباتات / الطحالب الحمض النووي. مصنع / algal الخلايا محاطة بجدران الخلايا المرنة التي تمنع التحلل التناضحي، ولكن الخلايا الحيوانية ليست كذلك. من الناحية النظرية هذا يعني أن أكثر الحمض النووي النبات / الطحالب قد يكون الحفاظ على داخل الخلايا اشتعلت على المرشحات قبل استخراج eDNA، في حين الحيوان تفقد الخلايا بسهولة النزاهة وتطلق الحمض النووي، مما يجعلها أقل عمراً مقارنة إلى eDNA القائم على النباتات. الاستدلالات حول سلامة الهدف من المرجح أن الحمض النووي للأنواع التي تستند إلى نتائج اختبار قائم على النباتات المشتبه به. وعلاوة على ذلك ، اختبارات لeDNA مجموع من عائلة من الكائنات الحية ، وجميع الأسماك ل على سبيل المثال، هي أيضا زائدة عن الحاجة. الحمض النووي الهدف يمكن أن يكون في وفرة منخفضة للغاية مقارنة بإجمالي eDNA، تبين أنه > 0.0004% من إجمالي eDNA في بعض الحالات [5]. من الناحية النظرية ، واختبارات لمجموع الأسماك أو eDNA البرمائي على الأرجح لا تعطي معلومات ذات الصلة حول سلامة نوع واحد الهدف eDNA ، وخاصة في الحالات التي يتم أخذ عينات من موقع معزول أو عمق حيث أخرى الكائنات الحية في عائلة قد لا تسكن. مثال نظري لمثل هذه الحالة هو عندما يكون موئل مبني من صنع الإنسان، أي نهر مُعالج، هو موطنه إلى فقط عدد قليل مختارة من الأنواع الرائدة أو إعادة إدخالها. في هذه الحالات، اختبار لمجموع الأسماك eDNA قد تفسر على أنها سلبية كاذبة بسبب انخفاض وفرة ، وليس النزاهة المنخفضة.

الدقة الحيوية مراقبة tripleLock ™ منصة يجمع جوانب متعددة من البيولوجيا الجزيئية، وتصميم المسح البيئي و أخذ العينات ، والابتكارات الرائدة لإنتاج الذهب eDNA الدراسات الاستقصائية القياسية. الـ تطوير منصتنا يرتكز على أفضل الممارسات لاستقصاءات eDNA وكذلك معايير مثل المبادئ التوجيهية MIQE، مما يجعل الدقة مراقبة حيوية رائدة في هذا المجال لاستقصاءات eDNA.

مراجع:

1. ويلكاكس TM، كاريم KJ، عضو الكنيست الشباب، McKelvey KS، فرانكلين TW، شوارتز MK. تعليق: أهمية الصوت منهجية في أخذ عينات الحمض النووي للبيئة. شمال Am J الأسماك إدارة. 2018; 1–5. دوي: 10.1002/nafm.10055

2. غولدبرغ CS، CR تيرنر، دينر ك، كليموس KE، تومسن الجبهة الوطنية، ميرفي MA، وآخرون. الاعتبارات الحاسمة بالنسبة لـ تطبيق أساليب الحمض النووي البيئي للكشف عن الأنواع المائية. اساليب (إيكول إيفول) 2016;7: 1299–1307. دوي: 10.1111/2041-210X.12595

3. بوستين SA، بينيس الخامس، غارسون JA، هيلمانس J، Huggett J، Kubista M، وآخرون. المبادئ التوجيهية لـ MIQE: الحد الأدنى معلومات لنشر تجارب PCR الكمية في الوقت الحقيقي. كلين تشيم 2009;55: 611-622. دوي: 10.1373/clinchem.2008.112797

4. توماس AC، غولدبرغ CS، هوارد J، نغوين PL, Seimon TA, توماس AC. ANDe TM : A متكاملة تماما نظام أخذ عينات الحمض النووي البيئي. 2018;2018: 1379–1385. دوي: 10.1111/2041-210X.12994

5. تيرنر CR، بارنز MA، شو CCY، جونز SE، Jerde CL، لودج DM. توزيع حجم الجسيمات والتقاط الأمثل من eDNA ماكرو مائي. (جيلبرت م) محرر أساليب ايكول ايفول. 2014;5: 676–684. دوي: 10.1111/2041-210X.12206

استكشاف معايير MIQE مثل للكشف عن qPCR الجزيئية المستندة إلى eDNA

استكشاف معايير MIQE مثل للكشف عن qPCR الجزيئية المستندة إلى eDNA

في السابق بلوق، وتطرقنا بإيجاز على معايير MIQE - المبادئ التوجيهية المنشورة لتعزيز الحد الأدنى من المعايير للإبلاغ عن بيانات qPCR من التجارب السريرية، وتستخدم للكشف عن التغيرات النسبية الصغيرة في التعبير الجيني داخل الخلايا أو الأنسجة، أو لتحديد كمية من مسببات الأمراض. بقدر يتم إجراء عمل الحمض النووي البيئية المعاصرة باستخدام نهج qPCR، فمن من المعقول فقط أن يتم وضع معايير مماثلة للعمل eDNA، التي ينبغي - وسوف يجادل – تمتد إلى ما هو مقبول للتطبيقات السريرية.

هذا إلى حد ما عكس الاتفاقية في الدوائر العلمية ، كما هو الحال عادة أن التطبيقات السريرية تحتاج إلى عبء مرتفع من الأدلة لدعم أي استنتاجات مستمدة من البيانات التجريبية. ومع ذلك ، بسبب البيئة من eDNA، وتوزيعها في النظم الطبيعية مع مصادر محتملة لا تعد ولا تحصى جيل وتسوس ، متحالفة مع الطبيعة الهرمية لأخذ العينات ، وأعتقد eDNA يعرض حالة خاصة حيث ينبغي تطبيق معايير أكثر صرامة من الإعدادات السريرية بحيث الثقة في نتائجنا جديرة بالثقة.

ما هي الاختلافات الرئيسية في استخدام qPCR للكشف عن التغيرات في التعبير الجيني أو الفيروسية تحميل ، على سبيل المثال ، مع استخدام qPCR للكشف عن eDNA؟ يوضح الشكل سير العمل ل A) تنفيذ تحليل تعبير الجيني qPCR جنبا إلى جنب مع B) أ سير عمل eDNA العام. في A) المحقق لديه عينة من الأنسجة، داخل التي هناك مضمونة محتوى حمض النووي. تخيل أنهم يريدون اختبار لمستويات التعبير من الجينات التي يفترض أن تلعب إيجابية دور في تخفيف التوتر في النباتات الخاضعة للإجهاد البيئي. في مثل هذه الدراسات، يتم مقارنة مستويات التعبير ضد الجينات المرجعية المزعومة، التي يتم التعبير عنها دائما، بحيث يمكن أن تكون أي تغييرات في الجين المستهدف مقارنة بعد تطبيع مستويات التعبير. على الرغم من أن النباتات في السيطرة يجب أن المؤامرة تظهر التعبير قليلا عن الجين الهدف، فإنه لا يزال من المتوقع أن يتم العثور عليها ، وإن كان في مستويات مخفضة ، في الأنسجة النباتية الخاضعة لل استخراج الحمض النووي (في هذه الحالة، رسول RNA، الذي يتم تحويله إلى الحمض النووي (الحمض النووي التكميلي أو cDNA)) في عملية تسمى النسخ العكسي ، لذلك أن الهدف قابل لـ qPCR القائم على الحمض النووي. على هذا النحو ، يتوقع المرء الكثير من cDNA، إذا كان ليتم تصور باستخدام تقنيات هلام المختبر القياسية. هناك وسوف تكون دائما أكثر من ذلك بكثير -- ومستقرة -- التعبير عن الجينات المرجعية مرنا، وبتبعية cDNA. باختصار: هناك مصدر موثوق به من cDNA، الذي يشكل القالب لم مقايسات qPCR لكل من الجين المستهدف و الجينات المرجعية.

سير عمل عام لإجراء A) الجينات تعبير qPCR و B) eDNA qPCR

النظر بعد ذلك، الحمض النووي البيئي. ترك جانبا الإيكولوجيا المعقدة من eDNA إلى جانب واحد (تخضع لآخر بلوق وظيفة ولكن انظر استعراض ممتاز من قبل بارنز وتيرنر [2]) ، توزيع eDNA في جسم المياه هو إلى حد كبير زائلة وأقل بكثير تركيزات، مع عدم وجود ضمان بأن أخذ العينات سوف entrain جزيئات الحمض النووي أو الحطام الخلوي في أنابيب أخذ العينات أو على أوراق التصفية. هناك مصدر كبير من الخطأ في الرصد في هذه المرحلة ، والتي هي إلى حد كبير غائبة في دراسات التعبير الجيني ، على الرغم من أن كلا من تقاسم الأخطاء الإجرائية التي يمكن أن تؤثر على نجاح qPCR المصب. اعتمادا على العوامل بما في ذلك حجم من المياه عينات وحجم المسام من المرشحات، وكمية من إجمالي eDNA قد تختلف التي تم جمعها بشكل كبير ، على الرغم من أنه إذا كان تصور على هلام ، هو أقل من المرجح أن تحتوي على قدر الهدف مثل الحمض النووي الريبي المستخرج من الأنسجة تحولت cDNA.

أداء qPCR أما A) أو B) يتطلب أخذ كمية من إجمالي cDNA أو إجمالي eDNA لل تستخدم كقالب لردود الفعل. احتمالية اختزال هذا المقتطف وعدم الحصول على الكشف عن أعلى لeDNA، وذلك بسبب ندرة اضافية من الهدف في كل من عينة المياه – والتي قد لا يكون قد تم جمعها على الإطلاق – وبنادرة النسبية للجزيء الهدف في حساء من إجمالي eDNA جزيئات.  لeDNA لدينا اثنين عدم اليقين في أخذ العينات بسبب اثنين من الأحداث أخذ العينات - من جسم الماء ومن إجمالي eDNA – أن العمل على زيادة الخطأ الإحصائي الكامنة.

خط القاع: eDNA يحتاج إلى اعتماد أكثر حساسية، ويمكن القول، أكثر تحديدا من المقايسات التطبيقات السريرية. أكثر تحديداً؟ حسنا، في حين أن العديد من الجينات تتطور خلال التطور عن طريق الازدواجية والتباعد اللاحقة ، وهذه الأحداث هي المترجمة إلى الأسر الجينات حتى حين عند وضع مقايسة qPCR لجين مع عدد من التأديولوجيات التطورية مماثلة و paralogs، والنيوكليوتيد التباعد بين هذه الجينات وجميع الآخرين في الجينوم من نسيج واحد نوع ضخم، وdn وبالتالي تضخيم غير محددة من الجينات غير المستهدفة الموهن. ومع ذلك، عند استخدام علامة eDNA، أن تمتد نفس الحمض النووي (على سبيل المثال، COI locus) موجود في جميع غير الأهداف، كما تم توارثها من قبل مشترك سلف. ومع ذلك، فإن التطور زيادة عدد الاختلافات النوكليوتيد بين الأنواع كما تمر الأجيال. ومع ذلك ، قد تختلف في الآونة الأخيرة تا لا عرض ما يكفي بين اختلاف الأنواع لتصميم فحص مناسب – ولكن انظر بلوق السابقة لمعالجة متعمقة من تصميم المقايسة والهدف خصوصيه.

في القادم بلوق, سأناقش بالضبط كيف نقدر اللد, LOQ – اعتماد مزيد من MIQE المعايير – وكيف يمكننا تحسين مقايسة لاحتواء صارمة, تكرار و مقايسة eDNA القابلة للتكرار. للقيام بذلك، ليس فقط نحن بحاجة إلى تحسين الهدف، ولكن أيضا تحديد و الطلعة العوامل التي تدخل التباين في النظام، مثبطات PCR الأكثر الشائنة. سأصف كيف نستخدم توجيهات مثل MIQE والعناصر الاصطناعية الرقابة الإيجابية الداخلية لتحديد الموثوقية من نتائج eDNA. كما سنناقش في المستقبل، كيف أن بيئة eDNA ويمكن استخدام أداء الاختبار في التجارب التجريبية لتحسين الكشف (و (ج) من الدراسات المستهدفة للكشف eDNA.

[1] بوستين وآخرون (2009). المبادئ التوجيهية MIQE: الحد الأدنى من المعلومات نشر تجارب qPCR. الكيمياء السريرية 55, doi.org/41373/clinch.2008.112797.

[2] بارنز وتيرنر (2016). الـ علم البيئة من الحمض النووي البيئي والآثار المترتبة على علم الوراثة الحفظ. علم الوراثة الحفظ، 17، 1-17.

[3] دوي وآخرون (2017). البيئيه تحليل الحمض النووي لتقدير وفرة وطاقة الكتلة الحيوية من أسماك الدفق. بيولوجيا المياه العذبة، 62، doi.org/10.1111/fwb.12846.

 [4] Nevers et al. (2018). الحمض النووي البيئي (eDNA) : أداة لتحديد كمي وفيرة ولكن بعيد المنال goby جولة (Neogobius الميلانوستوموس). PLos واحد، 13، doi.org/10.1371/journal.pone.0191720.

[5] إيفانز وآخرون (2016). القياس الكمي لتنوع أنواع الأسماك والبرمائيات من الأسماك والبرمائيات عبر eDNA ميتابارودينغ. علم البيئة الجزيئية الموارد، 16، doi/10.1111/1755-0998.12433.

[6] هنتر وآخرون (2016). حدود الكشف من المقايسات PCR الكمية والرقمية وتأثيرها في غياب الحضور استطلاعات eDNA. علم البيئة الجزيئية الموارد، 17، doi/10.1111/1755-0998.12619.

[7] Forootan et al. (2017). اساليب لتحديد حد الكشف والحد من القياس الكمي في الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR). الكشف الجزيئي الحيوي القياس الكمي، 12، 1-6.

cDNA مقابل eDNA (رسم بياني لكيفية إجراء كل منها واكتشافه)؟ – مجموعة القطعية إلى حد كبير من إشارة مقابل إشارة عشوائية سريعة الزوال؛ # تقويمات / paralogs داخل الجينوم مقابل بين كل شيء؛ الأهداف ثابتة داخل الخلايا مقابل الزوال و الزمانية المكانية لتوزيع الأنواع والمنبئات من معدل السفك و تحلل eDNA في النظم الإيكولوجية. ***

الكشف عن eDNA – أهمية التحديد المقايسة والحساسية الجزء الأول: مقدمة إلى المبادئ التوجيهية MIQE و DNA تسلسل قاعدة البيانات جيل & Curation لتصميم مقايسة qPCR

MIQE – مقدمة موجزة

في عام 2009، قام بوستين وزملاؤه[1] بتقنين مجموعة من المتطلبات الدنيا لنشر بيانات كمية في الوقت الحقيقي عن سلسلة البوليميراز (qPCR)، ظاهرياً للاستخدام في مجالات الطب السريري والبيولوجيا الجزيئية، كوسيلة لضمان مجموعات بيانات صارمة تمكن المحققين من قياس التغيرات الدقيقة في التعبير عن جينات معينة أو في تقدير الحمل الفيروسي، على سبيل المثال. في دراسات التعبير الجيني، التغيرات الكسورية في إنتاج جزيئات رسول داخل الخلايا، ودعا mRNAs، والتي تنقل المعلومات الوراثية المشفرة في الجينات إلى شكل البروتين أو النهائي، تحتاج إلى أن ينظر إليها وذلك لاختبار الفرضيات الحاسمة من الاستيراد الفسيولوجية والطبية وحتى التطورية والإيكولوجية. يتناول بوستين وآخرون بعض المعايير الإلزامية الدنيا التي يجب الإبلاغ عنها لضمان استمرار الكشف القوي عن الأحماض النووية بتركيزات منخفضة. وقد اصطلحت هذه المعايير على المبادئ التوجيهية MIQE: Minimal Information لنشر Quantitative PCR Experiments.

سنناقش هذه المبادئ التوجيهية وكيف تقارن مع معايير eDNA في المشاركات المستقبلية ، ولكن في الوقت الحالي سنكشف عن الفرق الرئيسي بين الدراسات التي تحتج MIQE وتلك التي تنطوي على قياس الحمض النووي البيئي باستخدام qPCR: أن تركيزات eDNA ، اعتمادًا على الظروف التي يتم جمعها فيها ، من المرجح أن تكون عدة أوامر أقل من العديد من التغيرات الملحوظة في مستوى التعبير MRNA أو المستويات المطلقة من الجينوم الفيروسي الموجودة داخل الأنسجة. وبالتالي، نحن بحاجة إلى تعديل معايير MIQE لضمان حماية استطلاعات eDNA من الاتهامات بالمعايير المتراخية للغاية التي قد تؤدي إلى تكبد خطأ كبير من النوعين الأول والثاني (إيجابيات وسلبيات زائفة على التوالي). مثل الحمض النووي القديم (ADNA) من قبل ، يجب أن يرفع اكتشاف eDNA هذه المعايير إلى مستوى أعلى نظرًا للطبيعة الزائلة للجزيئات المستهدفة في الأنظمة الطبيعية المعاصرة.

أهمية التحديد والحساسية

مشترك مع ADNA والتطبيقات الطبية الحيوية من مقايسات QPCR، هو اعتماد حيوي على اثنين من شواهد اللمس من الكشف الجزيئية: التحديد (أو: ما هو احتمال الكشف بشكل غير صحيح عن غير هدف، والتي قد تؤدي إلى خطأ من النوع الأول إن لم يكن محددا تماما للهدف (الأهداف)؟) والحساسية (أو: ما هو احتمال الكشف عن تركيزات منخفضة للغاية من الأنواع المستهدفة، والتي، إذا لم يتم قياسها، قد يؤدي إلى خطأ من النوع الثاني؟) [2]- الخطوة الأولى جداً لتقليل مصادر الخطأ المحتملة هذه هي تصميم مقايسات قوية للغاية في السيليكو، والتي تعتمد ، بشكل حاسم ، على وجود بيانات جينية كبيرة من الكائنات المستهدفة والسيمباتية (المشتركة في التوزيع) غير المستهدفة التي يتم بها تصميم مقايسات تمييزية للغاية. ولهذا، فإن المعلومات الجينية لها أهمية قصوى؛ يجب على المرء جمع ورعاية مجموعة كبيرة من المعلومات تسلسل الجينية.

المعلومات هي المفتاح – وهو الأساس المنطقي لعلم الوراثة التطوري وعلم الوراثة السكانية لتوليد البيانات والعلاج

ما هي كمية المعلومات الجينومية الكافية؟ وكيف يمكننا أن نحاسب على مستويات عالية من التباين الجيني داخل الأنواع، وانخفاض مستويات الاختلاف في التسلسل الجينومي بين الأنواع ذات الصلة الوثيقة و/ أو الأنواع الشقيقة و / أو خفي؟ كل الأسئلة الممتازة، وكل منها يحتاج إلى إجابة مرضية، أو لا يمكن للمرء بضمير حي أن ينشر أو يتيح مقايسة عامة للأنواع المستهدفة المعنية.

Coda

في هذا المنشور، ناقشنا بشكل عام جمع البيانات وتنظيمها لتصميم مقايسة خاصة بالأنواع ليتم نشرها بشكل عام عبر مجموعة الأنواع، أو على الأقل في التجمعات التي تم إنشاء بيانات التسلسل منها. هنا في PBI ، ونحن أيضا تطوير طرق جديدة لذرة بعيدا حتى عن كثب حتى الأنواع ذات الصلة مع مستويات منخفضة من الاختلاف النيوكليوتيد. وفي نفس السياق، نأمل أيضاً في تصميم مقايسات خاصة بالسكان قد تكون قادرة على استهداف وحدات ذات أهمية تطورية فردية ووحدات الإدارة أو الحفظ (M/CUs)[9].

في المدونة التالية ، سنقوم بتطوير المعايير الدنيا المطلوبة لمقايسة eDNA qPCR الموثوقة والقوية والسمعة ، وكيف توسع هذه المتطلبات وتجميل تلك المبادئ التوجيهية الخاصة بـ MIQE. سوف نعالج بشيء من التفصيل المفاهيم LOD (حد الكشف) و LOQ (حد القياس الكمي) ونسأل: ما هي المعايير الضرورية الحاسمة (CARP) لتصميم، الأمثل والتحقق من صحة eDNA مقايسات؟

[1] بوستين وآخرون (2009). المبادئ التوجيهية MIQE: الحد الأدنى من المعلومات لنشر تجارب qPCR. الكيمياء السريرية 55, doi.org/41373/clinch.2008.112797.

[2] لاهوز - مونفورت وآخرون (2015). نُهج إحصائية لحساب الأخطاء الإيجابية الخاطئة في عينات الحمض النووي البيئي. موارد البيئة الجزيئية، 16، دوي: 10.1111/1755-0998.12486.

[3] هيل وآخرون (2012). أخذ العينات للدراسات الجينية السكانية القائمة على السواتل الصغرى: يكفي 25 إلى 30 فردا لكل مجموعة سكانية لتقدير ترددات الألايل بدقة.  PloS واحد، دوي : 10.1371 /journal.pone / 0045170

[4] لو وآخرون (2018). الميراث ثنائي الباري من الحمض النووي الميتوكوندريا في البشر. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم، دوي: 10.1073/pnas.1810946115

[5] بيناسون وآخرون (2001). pseudogenes الميتوكوندريا: الشهود التطور في غير محله. الاتجاهات في علم البيئة والتطور، 16، 314-321.

[6] سميث وسميث (1996). الاختلاف النيوكليوتيدات مرادفا: ما هو "التشبع"؟ علم الوراثة، 142، 1033-1036.

[7] فيلسنشتاين ياء (2003). الاستدلال فيلوجيني, سندرلاند (سيناور).

[8] كريت - لافرينيير وآخرون (2012). تأطير صورة الأسرة السالمونيدا فيلوجينيك: بيكتيري أكثر اكتمالا من زيادة تصنيف العينات. PloS واحد، دوي: 10.1371/journalpone.0046662.

[9] Palsbøll وآخرون (2006). تحديد وحدات الإدارة باستخدام البيانات الوراثية السكانية. الاتجاهات في علم البيئة والتطور، 22، 11-16.

استخدام الحمض النووي البيئي (eDNA) لرصد النظم الإيكولوجية المائية

إن رصد الحمض النووي البيئي – eDNA – هو في طليعة موجة جديدة من جهود الرصد المتقدمة تكنولوجيا. مع جذور في التربة وعلم الحفريات، تم استخدام eDNA لأول مرة للكشف عن كائن مائي متعدد الخلايا – الضفدع الأمريكي الغازي Lithobates catesbeianus- في ورقة علمية تاريخية من قبل فيسيتولا وآخرون. في عام 2008[1]. من خلال تطبيق تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخدم على نطاق واسع ، ولكن الحساس للغاية ، (PCR) - رد فعل "يضخم" تسلسل الحمض النووي المحدد في عينة ، فقط إذا كان الحمض النووي للأنواع موجودًا في كمية قليلة مع ذلك - اكتشف Ficetola وزملاؤه الحمض النووي للضفادع في الرواسب التي تمت تصفيتها من عمود الماء. لفهم السبب، فإن التعريف الحالي للعمل من eDNA – التي اعتمدتها معظم علماء البيئة – سوف تضيء: eDNA هو "... المواد الوراثية التي تم الحصول عليها مباشرة من عينات بيئية (التربة، الرواسب، المياه، الخ) دون أي علامات واضحة من المواد البيولوجية المصدر" (تومسن ويلرسلي 2015[2]). أمثلة على كيفية eDNA هو إلقاء من قبل كائن حي -- على سبيل المثال ، هنا ميدلاند رسمت سلحفاة Chrysemys picta -- موضحة في الشكل أدناه.

مدونة pic 1

في الشكل ، يتم التخلص من الخلايا المحتوية على الحمض النووي بشكل مستمر أو دوري من البطانات الداخلية لأمعاء السلحفاة ، والجهاز التناسلي ، من خلال قلس الطعام ، واستبدال خلايا الجلد والمخاط ، والخروج من مواد النفايات ، ومن خلال إطلاق الخلايا الجنسية (أي الحيوانات المنوية والبويضات). مرة واحدة في الماء، وحماية الحمض النووي إلى حد ما داخل الخلايا. في نهاية المطاف، يتم تقسيم الخلايا والحمض النووي يتم تحريرها في بيئة مائي حيث يتم العثور عليها في الحل. على الرغم من أن eDNA هو استنفاد من خلال عدد من العمليات البيولوجية والكيميائية والفيزيائية، فإنه سوف تبقى يجري تجديدها إذا كان الكائن لا يزال لا يزال العثور على العيش في المنطقة المجاورة. وهذا يعني أن إشارة eDNA ستكون أقوى كلما اقتربت من مصدرها ، وسوف تزداد أيضًا عندما يكون هناك المزيد من الأفراد في السكان المحليين ، إذا ظل حجم المياه على حاله. ولذلك، يمكن أن تكون إشارة eDNA مؤشراً موثوقاً على وجود الأنواع المستهدفة في موئل معين.

ما هي الفوائد الرئيسية لمراقبة eDNA؟ أولاً وقبل كل شيء ، ليست هناك حاجة لأخذ عينات فعلية من الأنواع ، وبالتالي تقليل الاضطراب المرتبط بالرصد المستهدف للمخلوقات الحية الحساسة للإجهاد. وعلاوة على ذلك، حيث يتم أخذ عينات المياه فقط، وعدد قليل من الناس، سيكون هناك انخفاض في البصمة البيئية المرتبطة جهود الرصد في حد ذاته. لأن PCR هو حساس للغاية الحساسية البيولوجية الجزيئية، مسح eDNA تميل إلى أن يكون الحساسيات أعلى بكثير لتكون قادرة على الكشف عن الأنواع النادرة أو خفي من الطرق التقليدية (على سبيل المثال، Schmelzle & Kinziger 2016[3]). ونتيجة لذلك، فإن الدراسات الاستقصائية الخاصة بالأنواع المحددة للـ eDNA قد تكون أيضا أكثر فعالية من حيث التكلفة من التقنيات التقليدية. وعلاوة على ذلك، يمكن لأي شخص أخذ عينة من المياه، باتباع تعليمات بسيطة، وإضفاء الطابع الديمقراطي على مشاريع العلوم المواطنة في جميع أنحاء العالم وتسهيلها. والواقع أن المحصول الحالي من الشركات التي تقدم خدمات الكشف عن المياه المضادة للأفراد يعتمد على نموذج لعينات المياه التي يجمعها الموظفون العاديون والفنيون للمعالجة مرة أخرى في مختبر مركزي.

ومع ذلك، بما أن eDNA هي تقنية ناشئة، فإن عدم اليقين قائم بشأن بعض الاستنتاجات المستخلصة من دراسات eDNA المبكرة. ومع ذلك، فإن هذه القضايا (أي مصادر "الخطأ") تخضع للتدقيق المستمر من قبل العلماء، بما في ذلك هنا في المراقبة الحيوية الدقيقة، لتقليل آثارها. وبذلك، يجب الاعتراف بجميع مصادر الخطأ المحتملة، كما هي مفهومة حالياً، وإدراجها في أي تطور تقني (أي تصميم وإنتاج وتثبت من صحة المقايسات الخاصة بأنواع محددة من أنواع PCR) أو بروتوكولات تشغيل معيارية للاستقصاءات الميدانية. على سبيل المثال، الكائنات الحية عرضة للتحرك طوال حياتها. وقد أظهرت الموسمية أن يكون عاملا قويا في نجاح الكشف eDNA (دي سوزا وآخرون. 2016[4]). ومن الضروري أن تجري الدراسات الاستقصائية بمعرفة شاملة عن بيئة الأنواع، بما في ذلك التبصر في التوزيعات الحالية وأفضليات الموائل، وإلا فإن عدم كفاية المسح سيؤدي إلى نتيجة سلبية خاطئة، أي استنتاج أن الهدف هو عدم وجودها بالفعل؛ فقط غير مكتشفة. وقد يؤدي عدم حساب السلبيات الزائفة إلى عواقب مالية خطيرة إذا أوقفت مشاريع البنية التحتية في وقت لاحق أو تُوقف أو تُترك بسبب إعادة اكتشاف الهدف من قبل إيكولوجي مقدام أو أحد أفراد الجمهور. يمكن أن تنتج السلبيات الخاطئة أيضًا عن تطور الفحص غير السليم ، والتقليل من شأن التنوع الجيني داخل الأنواع في مواقع تضخيم PCR ، والعملية المفككة الحالية التي تتم من خلالها معالجة عينات eDNA من قبل غالبية ممارسي eDNA.

كما ذكر سابقا، سوف تتحلل eDNA إذا تركت عرضة لعمليات العالم الطبيعي. ولذلك، فإن eDNA التي تم جمعها معرضة لخطر حدوث اضمحلال بعد أخذ العينات، حيث لن تكون هناك آلية لتجديد EDNA في سفينة الجمع، مما يقلل من إشارة EDNA وربما يفشل في الحصول على نتيجة إيجابية ل PCR. ولذلك فإن خطر تدهور الـ eDNA أثناء أخذ العينات - وخاصة في الأيام الحارة والمشمسة - وفي العبور من الحقل إلى المختبر، أمر بالغ الأهمية. قد يؤدي التخزين غير الملائم أيضًا إلى تدمير eDNA (على سبيل المثال، قد يؤدي تكوين بلورات الماء أثناء التجميد إلى "تمزيق" جزيئات الحمض النووي). ومما يزيد من تفاقم الوضع الراهن، على الرغم من أفضل الجهود التي تبذلها المختبرات المعاصرة، أنه لا يزال هناك خطر كبير من حدوث نتائج إيجابية زائفة ل PCR بوساطة نقل جزيئات الحمض النووي الهباءية بين المختبرات داخل المباني من خلال مسارات التهوية. يسعى معظم ممارسي eDNA إلى الفصل الفعلي بين معالجة عينات eDNA (على سبيل المثال، أوراق التصفية أو عينات المياه المترسبة) مع اكتشاف PCR في المصب ، ولكن حتى ذلك بعيد عن الغباء.

هنا في الدقة الحيوية، ونحن على مجموعة للكشف عن منصة للدولة من بين الفن الذي سيسعى إلى القضاء على، أو تقليل، هذه المصادر من eDNA التحليل وأخذ العينات الخطأ، من خلال القضاء على مراحل العبور إلى مختبر مركزي وتطبيق إجراءات التشغيل القياسية. وعلاوة على ذلك، فإننا سنزيد من سبب وجود حقل لكيميسيونة أحيائية ديمقراطية لا يتطلب أي تخصص تقني لإجراء عمليات فحص متطورة قائمة على الأنواع المحددة PCR. نظامنا، وذلك باستخدام مفصل PCR المقايسات، وسوف تسفر عن نتائج PCR eDNA في الوقت الحقيقي (< 2 hours from water sampling to PCR read-out), which can then be immediately disseminated to colleagues via the cloud.

وهدفنا هو إعطاء العاملين في سطح الفحم لرصد التنوع البيولوجي (من علماء البيئة المحترفين إلى مشاريع علم المواطنين المحليين)، والقدرة على إجراء دراسات استقصائية شديدة الدقة، وربما تكون شديدة التنسيق، وموجهة للغاية، لـ eDNA لضمان أفضل لسلامة تراثنا العالمي للتنوع البيولوجي لجميع الأجيال القادمة.

[1] فيسيتولا وآخرون (2008). الكشف عن الأنواع باستخدام الحمض النووي البيئي من عينات المياه. رسائل علم الأحياء، 4، 423-425.

[2] تومسن و ويلرسلي (2015). الحمض النووي البيئي – أداة ناشئة في مجال الحفظ لرصد التنوع البيولوجي في الماضي والحاضر. الحفظ البيولوجي، 183، 4-18.

[3] شميلزل وكينزيغر (2016). استخدام نمذجة الإشغال لمقارنة الحمض النووي البيئي بالأساليب الميدانية التقليدية للرصد الإقليمي للأنواع المائية المهددة بالانقراض. موارد البيئة الجزيئية، 16، 895-908.

[4] دي سوزا وآخرون (2016). ويتأثر احتمال الكشف عن الحمض النووي (eDNA) البيئي بالنشاط الموسمي للكائنات الحية. PLoS واحد، دوي: 10.1371/journal.pone.0165273