Detecting eDNA – The Importance of Assay Specificity and Sensitivity Part I: An Introduction to the MIQE Guidelines and DNA Sequence Database Generation & Curation for qPCR Assay Design

MIQE – مقدمة موجزة

في عام 2009، قام بوستين وزملاؤه[1] بتقنين مجموعة من المتطلبات الدنيا لنشر بيانات كمية في الوقت الحقيقي عن سلسلة البوليميراز (qPCR)، ظاهرياً للاستخدام في مجالات الطب السريري والبيولوجيا الجزيئية، كوسيلة لضمان مجموعات بيانات صارمة تمكن المحققين من قياس التغيرات الدقيقة في التعبير عن جينات معينة أو في تقدير الحمل الفيروسي، على سبيل المثال. في دراسات التعبير الجيني، التغيرات الكسورية في إنتاج جزيئات رسول داخل الخلايا، ودعا mRNAs، والتي تنقل المعلومات الوراثية المشفرة في الجينات إلى شكل البروتين أو النهائي، تحتاج إلى أن ينظر إليها وذلك لاختبار الفرضيات الحاسمة من الاستيراد الفسيولوجية والطبية وحتى التطورية والإيكولوجية. يتناول بوستين وآخرون بعض المعايير الإلزامية الدنيا التي يجب الإبلاغ عنها لضمان استمرار الكشف القوي عن الأحماض النووية بتركيزات منخفضة. وقد اصطلحت هذه المعايير على المبادئ التوجيهية MIQE: Minimal Information لنشر Quantitative PCR Experiments.

سنناقش هذه المبادئ التوجيهية وكيف تقارن مع معايير eDNA في المشاركات المستقبلية ، ولكن في الوقت الحالي سنكشف عن الفرق الرئيسي بين الدراسات التي تحتج MIQE وتلك التي تنطوي على قياس الحمض النووي البيئي باستخدام qPCR: أن تركيزات eDNA ، اعتمادًا على الظروف التي يتم جمعها فيها ، من المرجح أن تكون عدة أوامر أقل من العديد من التغيرات الملحوظة في مستوى التعبير MRNA أو المستويات المطلقة من الجينوم الفيروسي الموجودة داخل الأنسجة. وبالتالي، نحن بحاجة إلى تعديل معايير MIQE لضمان حماية استطلاعات eDNA من الاتهامات بالمعايير المتراخية للغاية التي قد تؤدي إلى تكبد خطأ كبير من النوعين الأول والثاني (إيجابيات وسلبيات زائفة على التوالي). مثل الحمض النووي القديم (ADNA) من قبل ، يجب أن يرفع اكتشاف eDNA هذه المعايير إلى مستوى أعلى نظرًا للطبيعة الزائلة للجزيئات المستهدفة في الأنظمة الطبيعية المعاصرة.

أهمية التحديد والحساسية

مشترك مع ADNA والتطبيقات الطبية الحيوية من مقايسات QPCR، هو اعتماد حيوي على اثنين من شواهد اللمس من الكشف الجزيئية: التحديد (أو: ما هو احتمال الكشف بشكل غير صحيح عن غير هدف، والتي قد تؤدي إلى خطأ من النوع الأول إن لم يكن محددا تماما للهدف (الأهداف)؟) والحساسية (أو: ما هو احتمال الكشف عن تركيزات منخفضة للغاية من الأنواع المستهدفة، والتي، إذا لم يتم قياسها، قد يؤدي إلى خطأ من النوع الثاني؟) [2]- الخطوة الأولى جداً لتقليل مصادر الخطأ المحتملة هذه هي تصميم مقايسات قوية للغاية في السيليكو، والتي تعتمد ، بشكل حاسم ، على وجود بيانات جينية كبيرة من الكائنات المستهدفة والسيمباتية (المشتركة في التوزيع) غير المستهدفة التي يتم بها تصميم مقايسات تمييزية للغاية. ولهذا، فإن المعلومات الجينية لها أهمية قصوى؛ يجب على المرء جمع ورعاية مجموعة كبيرة من المعلومات تسلسل الجينية.

المعلومات هي المفتاح – وهو الأساس المنطقي لعلم الوراثة التطوري وعلم الوراثة السكانية لتوليد البيانات والعلاج

ما هي كمية المعلومات الجينومية الكافية؟ وكيف يمكننا أن نحاسب على مستويات عالية من التباين الجيني داخل الأنواع، وانخفاض مستويات الاختلاف في التسلسل الجينومي بين الأنواع ذات الصلة الوثيقة و/ أو الأنواع الشقيقة و / أو خفي؟ كل الأسئلة الممتازة، وكل منها يحتاج إلى إجابة مرضية، أو لا يمكن للمرء بضمير حي أن ينشر أو يتيح مقايسة عامة للأنواع المستهدفة المعنية.

Coda

في هذا المنشور، ناقشنا بشكل عام جمع البيانات وتنظيمها لتصميم مقايسة خاصة بالأنواع ليتم نشرها بشكل عام عبر مجموعة الأنواع، أو على الأقل في التجمعات التي تم إنشاء بيانات التسلسل منها. هنا في PBI ، ونحن أيضا تطوير طرق جديدة لذرة بعيدا حتى عن كثب حتى الأنواع ذات الصلة مع مستويات منخفضة من الاختلاف النيوكليوتيد. وفي نفس السياق، نأمل أيضاً في تصميم مقايسات خاصة بالسكان قد تكون قادرة على استهداف وحدات ذات أهمية تطورية فردية ووحدات الإدارة أو الحفظ (M/CUs)[9].

في المدونة التالية ، سنقوم بتطوير المعايير الدنيا المطلوبة لمقايسة eDNA qPCR الموثوقة والقوية والسمعة ، وكيف توسع هذه المتطلبات وتجميل تلك المبادئ التوجيهية الخاصة بـ MIQE. سوف نعالج بشيء من التفصيل المفاهيم LOD (حد الكشف) و LOQ (حد القياس الكمي) ونسأل: ما هي المعايير الضرورية الحاسمة (CARP) لتصميم، الأمثل والتحقق من صحة eDNA مقايسات؟

[1] Bustin et al. (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of qPCR experiments. Clinical Chemistry 55, doi.org/41373/clinch.2008.112797.

[2] لاهوز - مونفورت وآخرون (2015). نُهج إحصائية لحساب الأخطاء الإيجابية الخاطئة في عينات الحمض النووي البيئي. موارد البيئة الجزيئية، 16، دوي: 10.1111/1755-0998.12486.

[3] Hale et al. (2012). Sampling for Microsatellite-Based Population Genetic Studies: 25 to 30 individuals per population Is enough to accurately estimate allele frequencies.  PloS One, doi: 10.1371/journal.pone/0045170

[4] لو وآخرون (2018). الميراث ثنائي الباري من الحمض النووي الميتوكوندريا في البشر. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم، دوي: 10.1073/pnas.1810946115

[5] بيناسون وآخرون (2001). pseudogenes الميتوكوندريا: الشهود التطور في غير محله. الاتجاهات في علم البيئة والتطور، 16، 314-321.

[6] سميث وسميث (1996). الاختلاف النيوكليوتيدات مرادفا: ما هو "التشبع"؟ علم الوراثة، 142، 1033-1036.

[7] فيلسنشتاين ياء (2003). الاستدلال فيلوجيني, سندرلاند (سيناور).

[8] كريت - لافرينيير وآخرون (2012). تأطير صورة الأسرة السالمونيدا فيلوجينيك: بيكتيري أكثر اكتمالا من زيادة تصنيف العينات. PloS واحد، دوي: 10.1371/journalpone.0046662.

[9] Palsbøll وآخرون (2006). تحديد وحدات الإدارة باستخدام البيانات الوراثية السكانية. الاتجاهات في علم البيئة والتطور، 22، 11-16.

Share on facebook
Share on twitter
Share on linkedin
Share on email

Related Posts

من نحن
Founded in 2016, Precision Biomonitoring provides industry-leading expertise in molecular direction of organisms. Their very own TripleLock™ technology aims to deliver rapid, on-site environmental, food, animal and human diagnostic testing solutions. Customers are any organizations that need onsite surveillance and rapid identification of any organism in any environment. The Precision Biomonitoring team is at the forefront of technological innovations in the genomics industry. Our vision is a world where we can identify any organism on the spot, in an instant, anywhere on the planet.